2022 Fiscal Year Research-status Report

In vitro study on effects of antimicrobial photodynamic therapy against bacterial pathogenicity

Research Project

Project/Area Number	21K09923
Research Institution	Nihon University
Principal Investigator	平塚浩一日本大学, 松戸歯学部, 教授 (80246917)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2025-03-31
Keywords	抗菌的光線力学治療 / 微生物 / 病原性 / レーザー / LED / a-PDT / 遺伝子発現 / Candida albicans
Outline of Annual Research Achievements	半導体レーザーや発光ダイオード（LED）に光感受性色素を組合せた抗菌的光線力学治療（a-PDT）が，従来の機械的除菌治療を補完しうる新たな術式として発展が期待されているが，これまで報告された研究の多くが殺菌効果を検証したものであり，死には至らないものの病原性の変化に着目し評価した報告はほとんどない。そこで本研究は，光線力学療法による静菌・殺菌効果にとどまらず，微生物の病原性変動に焦点をあて，a-PDTやレーザー単体での照射（PDT）による遺伝子発現変化，形態学的変化，および生化学的変化を総合的に検証し，将来的に歯科臨床の場での新たな光線力学療法の応用の拡大の可能性を探っている。本年度は特に，歯周病やインプラント周囲炎，誤嚥性肺炎の関連菌の一つとして挙げらている真菌に属す常在菌Candida albicansに着目し，光線力学療法による影響を調査する実験系を整えた。検討内容は，①Candida albicansの増殖時の形態変化の観察; Candida albicansを生食でOD1.0（λ＝660;）に調整し100倍希釈液をRPMI溶液で培養し，２時間おきに光学顕微鏡にて観察した。②Candida albicansの増殖曲線作成；Candida albicansを生食でOD1.00に調整しRPMI液体培地とサブロー液体培地それぞれ100mlに100倍希釈をし，30℃と37℃にて培養を行い，1時間おきに濁度を計測した。③Candida albicansのRNA抽出；Candida albicansを生食でOD1.0に調整し100倍希釈液をRPMI溶液で培養し，その後②の実験結果で得た定常期に達した濁度の溶液を2ml、25mlと採取してFastPrepを用いてRNA抽出方を行った。使用するMatrixB,C,KでRNAの収量を比較検討した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 培養開始時点から2時間おきに光学顕微鏡にて観察するとCandida albicansは培養開始2時間後が菌糸形態の割合が一番多くその後に酵母系の割合が増えていった。今後は，増殖曲線のどの位置で実験を開始するかを突き合わせ，実験開始時等に刺激を加え、この形態変化の割合が変化するかを観察する必要がある。また，真菌からのRNA抽出を同じ菌体重量の細菌と比較すると収量が極めて少ない。これは次の遺伝子発現解析とリアルタイムPCRによる検証を考えた場合，大きな問題であり悩ませる。培養量を増やすことや，より破壊効率の高い適正なビーズを探し出すこと，または真菌の細胞壁溶解液の使用等を考える必要があった。すでにMatrixビーズの種類を様々試し適正なものに合わせることで採取量は増えているが，収量が思いの外安定しない。さらなる工夫を加えることが必要と考える。昨年、文献から試みる価値がある真菌用のMatrixビーズが見つかり昨年９月に発注したが，国内には無く、さらにコロナの影響で輸入が用意では無かったために未だに入手できていない。加えて，カスタムマイクロアレイによる遺伝子発現プロファイルを調査するために，他の研究者と科学研究費を折半しPCを購入と解析ソフトを購入したが，PCの入手も当時困難で，数ヶ月かかったために研究計画が全体的に遅延するに至った。
Strategy for Future Research Activity	病原性カンジダに関しては後にマイクロアレイ解析を進めることが可能な株で，かつ酵母型・菌糸型などが再現性良く得られる実験系を確立する。その後に， ①PDT照射による酵母型の増殖抑制・殺菌効果，②aPDT処理による酵母型の増殖抑制・殺菌効果，③PDT照射による酵母型から菌糸型への移行の影響，④PDT照射による菌糸型の変化（短縮・変化無し・延長）等についてのPDT照射による影響の有無を観察や遺伝子発現変動などで確認する予定である。レーザー効果による病原性変動が確認でき次第，菌体の全遺伝子カスタムアレイを作成しマイクロアレイ解析を施し，主な変動遺伝子に関してはリアルタイム PCRにて再度確認作業を施す予定である。またアレイ解析で得られた網羅的な変動結果はGene Ontology解析をすすめ，レーザー効果の流れを捉えたい。歯周病に関してはPorphyromonas gingivalisをターゲットとし，LEDレーザー照射後の線毛発現，プロテアーゼ活性，赤血球溶血活性，自己凝集および共凝集などの病原性の変動を経時的に観察し，必要であればRNAとタンパク質の抽出を行う。さらに歯周組織の炎症発症には菌体表層から分離するベジクルもまた重要な病原因子であることから，ベジクルへのレーザー照射を行い，その前後でのベジクルの病原性の変化や，細菌へのレーザー照射前後でのベジクル放出量の変動や性状変化に焦点をあて確認する。
Causes of Carryover	次年度使用額が生じた理由は研究計画の若干の遅延の影響に他ならない。各々の実験系においてレーザー照射前後の比較結果を確かなものにするためには，検討すべき様々な要素がある。特にCandidaを対象とするに当り，酵母型から菌糸型への形態変化は非常に重要なポイントである。これには条件変化により菌糸型に移行しやすい株であり，かつ，そのゲノムが登録されている株を選択する必要があった。酵母から菌糸型の移行条件もかなりシビアであり要検討すべき点が多かった。特にCandidaのRNAを抽出する最善の方法を見つけるのが難しく，その材料である破壊ビーズの海外からの購入が大幅に遅れたため。さらに国内外の学会出張がコロナで断念したため。また使用計画に関しては，カンジダのカスタムマイクロアレイの枚数を増やすことと遺伝子解析に必要な試薬と備品の整備，およびリアルタイムＰＣＲ試薬の購入に使用する予定である。さらに遅れている歯肉上皮細胞に対するレーザー照射の影響やP. gingivalisやC.albicansを付着させた上皮細胞に対するレーザー照射前後での宿主細胞内の遺伝子発現の変化（特に炎症性サイトカイン類）を確認するために使用する計画である。