2021 Fiscal Year Research-status Report
歯周組織再生におけるLRP1の機能的役割とシグナル経路の解明
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21K09941
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
二宮 禎 日本大学, 歯学部, 准教授 (00360222)
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2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | LRP1 / 歯周組織再生 / 歯根膜幹細胞 / 骨芽細胞分化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、新たな歯周炎治療法および歯周組織再生法を開発するために、歯周組織代謝の調節因子とその作用機序を解明することを目的としている。令和3年度では、歯周組織再生に関わる細胞にlow density lipoprotein receptor-related protein 1（LRP1）が発現することを明らかにした。歯根膜細胞（PDLs）におけるLRP1の役割を調べるために、マウスのPDLsを採取し、siRNAによってLRP1発現を抑制すると、PDLsのBMP-2, BMP-4, osteoprotegerin（OPG）の発現レベルが低下し、一方、RANKL発現が増加した。また、歯根膜幹細胞（PDLSCs）であるleptin receptor（Lepr）陽性細胞を単離し、siRNA処理をすると、PDLsでみられた遺伝子発現の変化が強く表れた。これらの結果は、PDLSCsのLRP1が骨代謝を制御する可能性を示唆している。次に、Lepr-creマウスとLRP1 floxマウスを交配して、Lepr陽性細胞からLRP1発現を欠損させたマウス（cKO）を作成した。cKOマウスから採取したPDLsの遺伝子発現を調べると、siRNAの実験と同様に、BMP-2, BMP-4, OPGの発現は野生型（WT）マウスに比べて低くなることに加えて、osterixの発現も低下した。さらに、硬組織形成能を調べるために石灰化誘導培地で培養すると、WTのPDLsは、10日間で石灰化基質を形成したが、cKOのPDLsには石灰化基質は認められなかった。これらの結果は、cKOのPDLsは、osterixの発現が低いため、骨芽細胞への分化が抑制されて石灰化できなかったと考えられる。以上のことから、PDLSCsのLRP1が骨形成に対して重要な働きを担っていることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
現在、本学の動物飼養施設の移転のため、動物実験が滞ってしまっているのだが、それを踏まえた実験計画を立てていた。それに加えて、本実験の根幹となる部分を実現可能な実験系で構成していたため、想定どおりの結果を得ることができた。また、令和3年度の実験に関しては、予備実験を行っていたこともあり、siRNAやKOマウスを用いた実験を円滑に遂行することができた。実験に使用する試薬も予定通りに入手することができ、実験遂行の妨げにはならなかった。以上のことから、本研究は、おおむね順調に進展しているといえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
発生過程におけるLRP1発現の検討：C57BL/6マウスの胎生(E)15日 (雷状期)、E17（帽状期）、E20（鍾状期前期）、生後(P)7日齢（鍾状期後期）、およびP14（歯根形成期）の組織切片を作製し、LRP1発現を検索する。本実験によって、発生過程の歯周組織形成に寄与する細胞にLRP1発現が高いことを明らかにする。
Lepr陽性歯根膜細胞の性状の検討：マウス由来PDLsからLepr陽性PDLsをFACSで単離し、細胞増殖能、細胞遊走能、骨芽細胞分化能、および血管新生能を評価する。さらに、Real-time PCR解析によって、間葉系幹細胞マーカー発現を検索することで、細胞性状を明確にし、幹細胞能を有することを明らかにする。
歯周組織形成におけるLepr陽性細胞のLRP1発現の関与：Lepr-LRP1マウス（生後4週、8週、および12週齢）の歯周組織形成および細胞局在をマイクロCT解析および組織化学的手法によって検討する。Lepr-LRP1 PDLからLepr陽性細胞をFACSで単離し、前述の実験の細胞性状解析を行う。この実験から、Lepr陽性細胞のLRP1が幹細胞の機能に関与することを明らかにする。さらに、マイクロアレイで網羅的に遺伝子解析を行い、変動の大きい遺伝子に着目して、LRP1によるシグナル伝達経路を解明する。
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| Causes of Carryover |
本学の動物飼養施設の移転に伴い、新たな施設への搬入に関して、これまで飼育していた動物をクリーン化する必要があったため、令和３年度の経費に計上していた。動物を新たな施設へ搬入できるのが４月１日以降であるため、支払いは令和４年度になる。したがって、クリーン化に必要な胚作製、胚からの個体作製、凍結保存、微生物品質検査、マウスの輸送などにかかる費用が次年度使用額になった。この次年度繰越金は、令和4年度助成金と合わせて、前述したクリーン化に必要になる費用や機能学的解析および形態学的解析の物品費に使用する予定である。
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