2021 Fiscal Year Research-status Report
骨基質中のTGF-βが破骨細胞に与える影響とカップリング機構の解明
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21K09945
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| Research Institution | Tsurumi University |
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Principal Investigator |
大熊 理紗子 鶴見大学, 歯学部, 学部助手 (50804887)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山本 竜司 鶴見大学, 歯学部, 講師 (20410053)
唐木田 丈夫 鶴見大学, 歯学部, 講師 (40367305)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 破骨細胞 / TGF-β / カップリング / リモデリング / カップリング因子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
骨基質中には不活性状態の潜在型TGF-β（latent TGF-β）が豊富に含まれており、破骨細胞による骨吸収が起こると、骨基質中のlatent TGF-βが放出されて活性型TGF-βに変換される。この現象をin vitroで再現し、TGF-βが破骨細胞自身に与える影響を検討することを本研究の目的とした。
本年度はプレート表面のlatent TGF-β接着の検討のため、免疫蛍光染色を行った。細胞培養で用いるプレート作製において、プレート表面にlatent TGF-βを共有結合させ、その上にCaをコーティングする前に、実際にlatent TGF-βが接着できているかを、抗TGF-β抗体を用いた免疫蛍光染色で確かめた。その結果、プレート上でlatent TGF-βが均一に蛍光発色している様子が観察された。さらに、作製したlatent TGF-β結合Caプレート上でマクロファージ由来RAW264細胞をリコンビナントRANKL存在下で培養し、破骨細胞に分化させた後、骨吸収の様子をPit Assayにて測定した。その後、使用したプレート表面をEDTA溶液によってCaを脱灰して取り除き、TGF-βの免疫蛍光染色を行った。その結果、Pit AssayでPitが観察された部分においてのみ、TGF-βは発光を示さなかった。この結果は、骨吸収による骨基質中のlatent TGF-βの放出と活性化が再現されていることを示している。
また、TGF-βによる破骨細胞の骨吸収関連因子の変化を検出するため、定量的RT-PCR法を行ったところ、破骨細胞分化マスター遺伝子のNFATc1、RANKL受容体のRANKなどがTGF-βによって発現が促進された。これにより、骨基質から放出されたTGF-βは破骨細胞の分化・活性化を促進することが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
培養に用いているRAW264細胞はロットによって、RANKLによる破骨細胞への分化・骨吸収活性に多少の誤差が生じる。そのため、培養の際に使用するRANKLやlatent TGF-βの濃度を検討するのに時間を要した。また、本年度は免疫染色、定量的PCRの他にタンパク実験も行った。しかし、遺伝子レベルで有意な差が得られた因子についてのタンパク実験で、検出が上手くいかなかったものもあり、さらに検出方法を模索中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は以下の３つの実験を予定している。TGF-βによって破骨細胞の骨吸収が促進されるのはなぜか？という問いに対する答えを見出すため、その関連物質の特定について次の実験を実施する。①骨吸収関連遺伝子の定量的PCRを行う。また、定量的PCRによって得られたデータをもとに、②関連物質のタンパク実験（SDS-PAGE、ウエスタンブロッティング）を行う。さらに、③組織学的解析（細胞骨格の観察、免疫染色）を行い、TGF-βが破骨細胞の形態に影響を与えているか検討を行う。
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