2022 Fiscal Year Research-status Report
甘草由来フィトケミカルによる気管支調節機構の分子機序解明
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21K10108
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
脇田 亮 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 准教授 (60376712)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
船山 ひろみ 鶴見大学, 歯学部, 講師 (00359530)
生駒 俊之 東京工業大学, 物質理工学院, 教授 (20370306)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 気管支平滑筋 / フィトケミカル / カルシウムチャネル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
気管支狭窄の機序の一つとして、気管支平滑筋細胞内でのカルシウイオンやcAMPを介した調節機構に注目している。また、その調節に影響を及ぼすものとして漢方生薬由来物質に注目し、気管支平滑筋調節機構の解明を目指してきた。そのなかで甘草由来フィトケミカルを用い、気管支収縮の直接的調節機構、気管上皮由来のメッセンジャーを介した間接的な平滑筋調節機構、ならびに気管上皮の安定化作用の解明を目指している。
先行研究で、漢方生薬合剤抽出物にmyosin light chain（MLC）のリン酸化抑制すなわち平滑筋収縮抑制効果がみられている。構成薬の一つである甘草の主要成分glycyrrhizic acidに加えLiquiritigeninの作用経路として、PLCβを介する収縮系とPKAを介する抑制系の細胞内情報伝達経路を検討した。培養気管支平滑筋細胞においてHSPを指標としたcAMPシグナル伝達経路であるPKAを介した経路は活性化させなかった。一方PLCβに対する直接作用としては、結果的に抑制傾向が認められたが有意差はなかった。現在他の甘草抽出成分であるGlabridinやLiquiritigeninおよびその誘導体を用いて再度PDE４阻害作用に着目し、検討を進めている。また、glycyrrhizic acidに関しては、PKCを介さない平滑筋収縮経路としてRhoキナーゼ（ROCK）にも着目し、Y-27632を対照としてMLCリン酸化を検証する。気管上皮細胞のPGs産生能はglycyrrhizic acidの前処理によっては変化しなかった。極性を持った細胞を培養しまた検討するとともに、また他のフィトケミカルにおいても検討を加える。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
筋収縮発現に影響する細胞内カルシウムイオン測定が可能な蛍光プローブの反応性の確認はコロナ禍のなか、綿密な情報交換により時間はかかったものの概ね終了している。また筋小胞体内カルシウムイオン濃度変化の直接的検討のために必要な細胞膜透過処理とその後の蛍光プローブを利用した細胞内カルシウムイオン濃度測定は、情報提供を受けているものの処理が安定していない。またカイネティックアッセイ専用ではないプレートリーダーによる測定を継続しており作業効率は低いままである。現在代替の方法としてその一方培養関連保管設備に関しては、新規平滑筋細胞株を用い反応性の再確認を行い従来の細胞株と同程度の反応が得られることを確認しており当初予定通りの培養が可能となっている。一方上皮細胞による測定は新たに導入した研究であるが想定通りの結果を得られず、極性付与を検討中である。そのため、安定した培養が可能な気管支平滑筋を用い、細胞間情報伝達への甘草由来成分の影響を評価するため、carbenoxoloneと比較を行う。COVID-19パンデミックによる動物実験設備の使用制限が解除されたが、予定していたマウスを用いたex vivo解析を行う設備の使用目処は未だ立っていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
進捗状況の改善策として、気管支平滑筋細胞を用い、cAMPを介したPKA産生による気管支収縮抑制作用においては、他のLiquiritigenin，glycyrrhetinic acidなどの甘草由来フィトケミカルを用いアデニル酸シクラーゼ阻害剤やPDE4阻害に対する影響を検証する。またPLCβの関与する経路だけでなく、関連しないRhoA/ROCK経路も検討する。さらに細胞間情報伝達への甘草由来成分の影響を評価するためGap結合への影響をcarbenoxolone処理により検討する。また芍薬由来成分であるPaeoniflorinの存在下におけるアセチルコリン・ヒスタミン刺激の［Ca2+］iあるいは細胞内PLCβ活性へ及ぼす影響も検討する。一方気管上皮細胞の培養安定化に努め、PGs産生についても再評価する。また甘草由来成分にはPLA2を抑制することでこれを介する炎症性メディエータを抑制する可能性もあり、上皮のPLA2産生量への影響を検討する。マウス摘出気管支を用いたglycyrrhizic acidの気管支収縮抑制効果あるいは全身麻酔下マウスへの直接気管内投与など、in vivo/ex vivoの解析は設備が使用可能になり次第検証する。
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| Causes of Carryover |
COVID-19パンデミックによる、動物実験室使用再開後の研究室利用制限および申請過多により、計画通りに研究が遂行できず、必要な実験器材・試薬などを購入しなかった。また渡航・出張制限もあり、学会等情報収集や研究打合せなどの出張も行われなかった。これらの理由により次年度使用が生じた。加えて一部の細胞培養が予定通りに進まず、関連した研究に予測した結果が得られなかった。
研究室の利用や新規実験の開始も許可され始め、徐々に研究再開する部分も現れた。当初計画より遅延した分野においては、測定対象を変更するとともに、研究協力者の施設にある機材設備あるいは研究者の所属する施設の供用設備での同時並行処理を検討するとともに、測定方法を再度検討する。それに伴う施設使用料・ディスポ製品や各種試薬の追加購入などに費用は追加使用する予定である。
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