超遠心法による分画抽出血清のプロテオーム解析を利用した新規硬組織形成誘導法の開発

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K10162
• Research Institution: The University of Tokushima
• Principal Investigator: 上田 公子 (山口公子) 徳島大学, 病院, 助教 (40335807)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 岩本 勉 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 教授 (90346916) ; 北村 尚正 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 助教 (50614020) ; 赤澤 友基 徳島大学, 病院, 助教 (10646152)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 硬組織形成 / ウシ胎児血清 / 超遠心 / 歯原性間葉細胞 / 細胞分化

Outline of Annual Research Achievements

初年度は，これまで使用していたウシ胎児血清(Fetal Bovine Serum : 以下FBS)から、FBSのLotが変更となったため、硬組織形成細胞の分化に対する、超遠心法により得られたFBS分画についての、Lot変更の影響を検討することから研究を開始した。
FBSは，超遠心分離機にて100,000g×18時間超遠心し，3層に分かれた分画をそれぞれ回収し，最上方を第1層，中間層を第2層，最下層を第3層として使用した。
まず，それぞれの分画を10%含む培地にて、歯原性間葉細胞(mDP)を用いて、分化について検討するためアリザリンレッド染色を行った。結果は第1層の使用で，細胞が極端に増えず、石灰化の傾向は，はっきりとは認められなかった。そこで、最も効果的な第1層の使用量を確認することにし，第1層を1%，3%，5%，10%含む培地を使用し，同様の実験を行った。結果は第1層を5%含む培地の使用で通常より早い時期に石灰化が開始する傾向を確認できた。
次に、変更したLotのFBSについても、各分画のタンパク成分の検索を行い，各分画間での蛋白成分の差を確認するため、FBSの超遠心により得られた各分画と超遠心前のコントロールのFBSについてプロテオーム解析を行い，コントロールに比較して，各分画に特徴的なタンパク質の解析を行った。その結果，歯原性間葉細胞の分化を促進する所見のみられる第1層に、骨や軟骨等の硬組織について，分化への関与が報告されているFam3Cが特徴的に発現していることが確認できた。
今後，Fam3Cやプロテオーム解析にて示唆された他の分子について，硬組織形成細胞への影響を検討するとともに、そのメカニズムの解明を行い、象牙質再生または骨再生の新規治療方法の開発に繋がる研究を目指し、実践したい。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

令和３年度は，硬組織形成細胞として、骨芽細胞株、軟骨細胞株、歯原性間葉細胞株、歯原性上皮細胞株を用いて，硬組織形成を促進する因子の同定を目指す予定であった。
しかし、これまで使用中であったLotのFBSが入手困難となったため、Lotを変更したFBSについて，歯原性間葉細胞株を用いた、分化についての影響を確認するための実験から、研究を開始した。Lotの変更されたFBSの第1層の使用により，かなり極端に細胞増殖が抑制され，当初は何らかの実験上のエラーと考えたこともあり，Lotの違いで細胞増殖が極端に抑制された結果、分化にも影響がでて、第1層の使用で，早期から石灰化が開始される傾向を認めたものの，結果が安定せず，歯原性間葉細胞の石灰化の評価について，結果を得ることに時間を要した。
歯原性間葉細胞と歯原性上皮細胞の増殖と分化について，超遠心したFBS各分画のLot変更の影響を確認した後，細胞遊走試験やその他の骨芽細胞株、軟骨細胞株を用いた実験，硬組織形成細胞の増殖や分化を促進する標的分子の発現を確認するための実験を予定していたため，歯原性間葉細胞へのLotの違いによる各分画の分化への影響の確認に時間を要してしまい，硬組織形成を促進する因子を同定するための実験が十分に行えなかった。

Strategy for Future Research Activity

令和３年度の研究で，超遠心法により得られたFBS分画の歯原性間葉細胞への分化に対する効果について，Lotの変更されたFBSを使用しても、第1層は石灰化を促進する所見が得られ、さらに、プロテオーム解析にて各分画のタンパク成分の検索を行い，各分画間で蛋白成分の差が確認できたため，令和４年度は，プロテオーム解析の結果から、歯原性間葉細胞の分化を促進する所見のみられる第1層に特徴的に発現し、骨や軟骨等の硬組織について，分化への関与が報告されているFam3Cを含む分子や、これまでの研究から増殖を促進する所見の見られる第３層に特徴的に発現する分子について実験をすすめ、それと並行して，歯原性上皮細胞、骨芽細胞株や軟骨細胞株についても，超遠心法により得られたFBS分画の増殖や分化に与える影響を、増殖試験（細胞カウント、BrdU）、ALP活性、アリザリンレッド染色、細胞遊走試験にて確認し、硬組織形成細胞の増殖や分化を促進する分子の同定を行う。硬組織形成細胞の分化を促進する標的分子としてまずFam3Cから、確認の実験を開始する予定だが、この実験の結果しだいでは、プロテオーム解析の結果注目されたその他の分子についても網羅的に検討し、硬組織形成細胞の増殖や分化を促進する分子の同定を行う。
その同定された分子について、Western blotting法やreal time RT-PCR法を用い、それぞれの細胞に発現するタンパクや遺伝子の解析を行い、硬組織形成促進のメカニズムを解明する。
また，効果的な石灰化誘導法の開発や効率的な硬組織形成の促進方法の開発を目指し,細胞培養系や、頭蓋冠開削モデルまたは歯の歯髄露髄モデルマウスを用いて、石灰化誘導促進効果や硬組織再生促進効果について検討を行い、臨床応用を目指す研究を実践したい。

Causes of Carryover

令和３年度の研究では，超遠心法により得られたFBS分画のFBSのLot変更による、歯原性間葉細胞の石灰化への影響の評価に時間を要し，細胞遊走試験やその他の歯原性上皮細胞、骨芽細胞株、軟骨細胞株を用いた実験が進まなかった。さらに，プロテオーム解析の結果から注目されたFam3Cを含む分子について網羅的に検討し、硬組織形成細胞の増殖や分化を促進する分子の同定を行う予定であったが，こちらも十分には実行できなかった。以上により，次年度使用額が生じたと考えられる。
令和４年度の研究では，令和３年度予定していた上記の研究に加えて，硬組織形成促進のメカニズムを解明するため，Western blotting法やreal time RT-PCR法を用い、それぞれの細胞に発現するタンパクや遺伝子の解析を行うとともに，効果的な石灰化誘導法の開発や効率的な硬組織形成の促進方法の開発を目指し,細胞培養系や、頭蓋冠開削モデルまたは歯の歯髄露髄モデルマウスを用いて、石灰化誘導促進効果や硬組織再生促進効果について検討を行い、臨床応用を目指す研究を実践する。このため，次年度使用額については，翌年度分として請求させていただいた研究費とあわせて、実験の消耗品として使用する予定である。