2022 Fiscal Year Research-status Report
歯の再生を目指したヒト乳歯歯髄幹細胞濃縮と機能解析
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21K10165
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| Research Institution | Kagoshima University |
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Principal Investigator |
稲田 絵美 鹿児島大学, 医歯学域鹿児島大学病院, 講師 (30448568)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐藤 正宏 国立研究開発法人国立成育医療研究センター, ゲノム医療研究部, 共同研究員 (30287099)
齊藤 一誠 朝日大学, 歯学部, 教授 (90404540)
野口 洋文 琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (50378733)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 乳歯歯髄幹細胞 / 細胞工学的手法 / アルカリホスファターゼ / 多能性幹細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
申請者らの過去の研究から「アルカリフォスファターゼ（ALP）高活性かつOCT-3/4陽性の細胞（以下、ALP(+)/OCT-3/4(+)と表記）は多能性幹細胞になり得る」と判断された。本研究では、細胞工学的手法によるHDDPC（ヒト乳歯由来歯髄細胞）由来ALP(+)/OCT-3/4(+)安定株樹立を目指す。同細胞の特性を解析する一方、マウス胎仔の歯槽堤部由来細胞との共培養による組織再構成実験を行い、当該細胞の機能性（多能性幹細胞の特性を有する細胞か否か）を明らかにする。
2021年度では、限界希釈法でHDDPCをsingle cell化した後、増殖させる試みを行ったが、維持・増殖が進まない状況にあった。そこで、わずかに増殖した各細胞からmRNAを回収し、遺伝子発現解析が可能な全トランスクリプトーム増幅法（WTA）を用い、幹細胞特異的遺伝子の発現をRT-PCR法にて調べた。その結果、cell cloneによってはALP等の幹細胞特異的遺伝子の発現様式が異なることが判った。
2022年度では、細胞の器官培養の適正条件について検討した。細胞増殖の足場となるscaffold にはvitroGel（TheWell）とMatrigel（Corning）を採用し、EGFP蛍光発現マウスB16 melanoma細胞を培養した。その結果、vitroGelではB16 melanoma細胞がscaffold周辺部に拡がったが、Matrigelではscaffold内部での増殖・拡大が認められたことから、Matrigel はin vitroでの細胞の3D構造構築に最適な素材ではないかと判断された。また、Matrigelを用いてiPS細胞からの三胚葉性分化細胞への分化誘導を検討したところ、その程度は低いものの分化誘導ができる可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
限界希釈法にてHDDPCをsingle cell化した後、増殖させる試みを行った。その結果、single cell化（cell cloning）はできるものの、その後の増殖は細胞によって差があること、一時的に増殖が達成されても、継続的な細胞拡大は困難であることが判った。36 cloneがわずかに増殖したため、ALP発現の有無を組織化学的に検索した結果、ALP強発現は8％、ALP弱発現は22％、ALP無発現は70％だった。また、WTAを用いて幹細胞特異的遺伝子の発現をRT-PCR法にて調べた結果、cell cloneによって幹細胞特異的遺伝子の発現様式が異なることが判った。
一方、細胞の器官培養の適正条件について検討した。細胞増殖の足場となるscaffold にはvitroGelとMatrigelを採用し、EGFP蛍光発現マウスB16 melanoma細胞を培養した。5×108個/mLの高密度懸濁液を作製し、これを各scaffoldに包埋し、60マイクロL容積のドロップを作製した。30-mm dishに培地を3 mL注ぎ、3マイクロm孔径のisopore membrane filter（Merck Millipore）を培地の上に浮かべ、細胞含有scaffoldをフィルター上に載せ、器官培養した。その結果、vitroGelでは細胞がscaffold周辺部に拡がったが、Matrigelではscaffold内部での増殖・拡大が認められた。後者の凍結切片を作製してH-E染色したところ、一部不均一な構造体が見られた。Matrigelを使ってiPS細胞を器官培養したところ、培養14日で内部での細胞増殖・拡大を認め、組織切片内には低分化ではあるものの三胚葉性の分化細胞を認めた。以上の結果から、Matrigel はin vitroでの細胞の3D構造構築に最適な素材だと判断された。
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| Strategy for Future Research Activity |
2023年度は引き続き、HDDPCのsingle cell由来の細胞cloneの維持・増殖に関する実験を継続し、増殖が達成されたcell lineについては細胞工学的手法によるHDDPC由来ALP(+)/OCT-3/4(+)安定株樹立を目指す。一方、HDDPC内ではOCT-3/4(+)/ALP(+)細胞の数が少なく、このような細胞群のclone化は困難であることも判ってきた。歴史的には、分化細胞へのOCT-3/4遺伝子、あるいは、OCT-3/4タンパクの導入により、分化細胞が幹細胞様細胞に転換する（脱分化）ことが報告されている。そこで、HDDPCにOCT-3/4遺伝子導入などの分子生物学的介入を行い、HDDPC内でOCT-3/4を一時的に強制発現させることでHDDPCを脱分化させ、OCT-3/4(+)幹細胞様細胞の取得を試みる。これらの細胞はALP(+)となることが期待される。まずは、OCT-3/4発現ベクターを遺伝子導入し、一過的に当該タンパクを分化細胞内で強発現させ、脱分化の誘導を試みる。
最終的に得られたALP(+)/OCT-3/4(+)株については分化誘導剤を与え、神経や骨細胞等の分化細胞へin vitroで分化できるか、その多分化能性を検討する。一方、免疫染色やRT-PCR法にて他の幹細胞特異的マーカーSSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、NANOG、SOX2、REX1の発現についても検討する。
一方で、器官培養については、scaffoldのドロップサイズやフィルターサイズ、フィルターの孔の大きさを変更することで、3D構造構築後の細胞分化が最大となるような最適条件の検討を継続する。
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| Causes of Carryover |
2023年度は細胞への遺伝子導入実験の機会が増える見込みである。また、成果について学会発表、論文投稿を予定している。そのため、次年度使用額として翌年度分に助成金を持ち越した。持ち越した研究費は、細胞培養用試薬、分子生物学用酵素等の消耗品購入、学会参加費、出張費、論文校正、論文掲載費用として使用する予定である。
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Research Products
(5 results)
