象牙芽細胞突起の機能を有するヒト象牙質オルガノイド作成の試み

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K10176
• Research Institution: Fukuoka Dental College
• Principal Investigator: 岡 暁子 福岡歯科大学, 口腔歯学部, 准教授 (60452778)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: オルガノイド / 象牙質 / 象牙芽細胞 / 3Dプリンター / 細胞外マトリックス

Outline of Annual Research Achievements

象牙細管を有する、生体に近い組織構造を有する象牙質を再生されることを目的として、研究を開始した。歯原性間葉細胞が象牙芽細胞へと分化するには、エナメル上皮との相互作用は必須であるため、上皮細胞および間葉細胞を規則的に配列し培養する必要がある。従って、バイオプリンターを用いて、器官培養法にて「歯髄ー象牙質複合体」の作成を試みることとした。2021年度は、バイオプリンタ―に適合するスフェロイド体の形成条件の設定を行った。使用する細胞は、マウス頭蓋神経堤由来細胞株O9-1、マウスエナメル上皮細胞株mHAT9d細胞を用いた。培地も3種ほどのレシピで作成し、適度に分化を抑制し、かつ細胞増殖能を維持しながら、非接着培地で２－３日で550～600μmのスフェロイド体が形成される条件を模索した。
結果として、O9-1細胞を用いて、培養開始2日目で適切な大きさのスフェロイド形成となる条件を2種の培地を使用して決定した。ｍHAT9ｄ細胞でも同様に、スフェロイド形成条件を2種の培地を使用して決定した。各スフェロイド体から組織切片を作成し、HE染色およびKi67抗体を用いて免疫組織学解析を行い、細胞増殖部位を観察しコンディションの良いスフェロイド体が作成できていることを確認した。
バイオプリンターを用いて、それぞれのスフェロイド体による3次元構築を行った。組織学的な観察からは、内層の細胞成育状況が良くないため、ブリントの設計、構築後の培養方法には、改善が必要であることが明らかとなった。
O9-1細胞およびｍHAT9ｄ細胞からなるスフェロイド体を接触させて培養することも可能となり、この構造体の組織学的解析を進行中である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究で使用するバイオプリンターは、共同研究施設に設置されており移動による時間的ロスが多かったため、本学に近い施設に設置されている同種のバイオプリンターを使用できるよう話し合いを行い、また本学内に還流培養が可能な培養設備を整えることができたため、研究スピードが向上した。現在、3次元構築した組織を数例、作成することができており、計画どおりに進んでいると考えている。

Strategy for Future Research Activity

培養設備と、バイオプリンターが別施設に存在するため、細胞および組織塊の移動の効率化を図る。
最終的に上皮系細胞と間葉系細胞の2種の細胞で構造体を形成する計画であるが、それぞれの細胞マーカーを免疫染色を用いて組織学的に判断する手段しかないため、GFPやtdTomatoなどの蛍光蛋白ベクターの挿入なども検討し、組織切片形成までの時間を短縮できないか検討を予定している。また、免疫組織学的解析には、切片作成から染色まで様々な工程が必要であるため、qPCRを用いて細胞マーカーの発現の有無、発現量を検討していく。
2種の細胞を構築させ、細胞の配列に極性を持たせるために、バイオプリンターのスフェロイド構築プログラムを様々なパターンで検討し、マトリックス分泌を誘導する方法を確立する。

Causes of Carryover

コロナの影響によって、対面の学会が開催されなかったため、ウェブでの参加や講演が多く、旅費の支出がなかったため