2021 Fiscal Year Research-status Report
Transcriptional disruption in craniofacial neural crest by administration of drugs at the early stage of pregnancy possibly causes the HFM-like craniofacial malformation in rat embryos.
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21K10261
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| Research Institution | Ohu University |
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Principal Investigator |
今井 元 奥羽大学, 歯学部, 准教授 (90291343)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
鈴木 礼子 奥羽大学, 歯学部, 准教授 (90333723)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 頭部神経堤細胞(NCC) / 第1第2鰓弓症候群(HFM) / バルプロ酸(VPA) |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の作業目標は、『① 頭部神経堤の上皮間葉転換/脱上皮化(EMT)が、どのように阻害されるのか。② 頭部NCCの移動経路が、どのように攪乱されるのか。③脳神経の軸索ガイダンス因子が、どのように攪乱されるのか。④脳神経ニューロンの伸長が、どのように攪乱されるのか。⑤ 上顎・下顎・舌骨・耳小骨などに、どのような奇形を生じるのか。』などである。計画A～Eの進展状況は以下の通りである。本年度は、wistar系のラットを用いて、実験群と対照群のサンプル作成を行った。すなわち、母獣にVPA(実験群:500mg/kg)または生理食塩水(対照群)を単回投与し、胎齢9日目のラット胎仔を曝露し、in vivoでE9.5(計画A: 神経堤形成期) E9.5-E10.5 (計画B:頭部NCC移動期), E11.5 (計画C:軸索ガイダンス期)、E12.5 (計画D:脳神経ニューロン分化期), E20(計画E:鰓弓骨格形成期)まで発生させた胎仔を摘出した。作業目標①～⑤に対する計画A～計画Dの研究実績は以下の通りである。
計画A：現在、EMT関連因子(snail / slug /sox9)の局在を解析するための抗体、及び、プローブを作成している。
計画B：現在、最適なVPA投与時期を検証中である。また、NCC移動経路の撹乱を検証するため、Sox10のプローブを作成している。
計画C：軸索ガイダンス因子(Sema3A)の抗体を準備している。
計画D：現在までに、成熟ニューロンのマーカー(neurofilament)のWIHCを行った。
計画E：現在までに、アルシアンブルー-アリザリンレッド染色を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
以下の3点により、やや遅れている。
1.2022年3月16日の福島県沖地震により、研究室の整備に少し時間を要した。
2.新型コロナの影響により、動物や消耗品などの納入に時間を要した。
3.神経堤細胞の形成や移動及ぼす影響を正確に解析するため、実験動物の系統を、より厳密な発生ステージが安定したWistar Imamichiラット(以前はSDラット)に変えたことにより、VPAの投与時期の決定に時間を要した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、本年度、作成した実験群または対照群に対し、計画A～Eを行う。
計画A(E9.5:神経堤形成期): WISH/WIHCにて、中脳～後脳/ロンボメア(rh)における中脳～後脳/ロンボメア(rh)におけるEMT関連因子(snail / slug /sox9)の局在を解析する。
計画B (E9.5-E10.5;頭部NCC移動期): (1) DiI標識法と全胚培養を用いて、中脳～rh4-6のNCCの移動経路を解析する。(2) WISH/Real-time PCRにより中脳～rh1,2 (Sox10/Dlx3-6)及び rh4-6(Hoxa2)のNCCマーカーの局在を解析する。
計画C (E11.5; 軸索ガイダンス期)： 上記③の解明のために、VPA投与群 及び 対照群のラット胚において、軸索ガイダンス因子(Sema3A)の局在や左右差を解析する。
計画D: (E12.5; 脳神経ニューロン分化期):頭部NCC由来の脳神経（Ⅴ, Ⅶ, Ⅸ, Ⅹ）のネットワーク攪乱の検証 (VPA投与群 及び 対照群のラット胚において、成熟ニューロンのマーカー(neurofilament)、未熟なニューロンのマーカー(βⅢ tublin)、プラコードのマーカー(Pax3)、及び、運動ニューロンのマーカー(Islet 1)の局在や左右差の順に解析を進める。
計画E (E20; 鰓弓骨格形成期)：アルシアンブルー-アリザリンレッド染色を行ったサンプルの上顎・下顎・下顎の長径を計測し、左右差を検証する。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額が生じた理由は、 (1) COVID-19の蔓延、及び、(2)令和３年２月福島県沖地震による設備被害の影響が遷延したこと（令和４年３月の福島県沖地震による更なる被害も含む）により、海外から購入予定の抗体の入手が困難だったためである。次年度使用額は、令和4年度における消耗品の購入に充てる予定である。
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