2022 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of the mechanism that determines the site of fusion of myoblasts to myofibers
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21K11488
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| Research Institution | Okayama University of Science |
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Principal Investigator |
長田 洋輔 岡山理科大学, 生命科学部, 講師 (50401211)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | C2C12 / 骨格筋 / 筋肥大 / 筋分化 / 細胞融合 / 電気刺激 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
骨格筋はわれわれが体を動かすために必要な組織であり，損傷を修復する再生能と，使用状況によって肥大／萎縮する可塑性を持つ。筋肥大は，おもに筋線維のタンパク質合成量が増加することによって起こるが，骨格筋に大きな負荷が与えられた場合には，筋サテライト細胞に由来する筋芽細胞の融合によって新たな筋核を獲得する。筋細胞の融合には，myomakerやmyomerger等の筋細胞特異的な細胞融合関連タンパク質が関与することが明らかにされつつあるが，つまり細胞融合部位が決定される過程については十分に解明されていない。また，筋芽細胞同士の融合については理解が進んでいる一方で，筋線維と筋芽細胞の融合に関する研究は遅れている。その理由の一つとして，筋線維への細胞融合の検出が容易でないことが挙げられる。
当年度はマウス筋芽細胞株C2C12に細胞培養系で電気刺激を与える実験系の改良を試み，電気刺激誘導装置C-Pace EMを導入した。C2C12細胞を増殖促進的環境下において分化誘導し，24時間の電気刺激を与えることによって，再現性良く筋収縮を誘導することに成功した。その条件では，横紋形成が促進されることをα-actininの蛍光免疫染色によって確認した。さらに，再現性高くかつ効率よく筋分化を誘導するために筋分化制御因子MyoDをテトラサイクリン誘導システムによって発現誘導させられるC2Tet-MyoD細胞を樹立した。今後は，細胞融合の変化についての定量的評価および細胞融合部位を同定するための実験を行う。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当年度はマウス筋芽細胞株C2C12に細胞培養系で電気刺激を与える実験系の改良を試みた。C2C12細胞を5×10^4個/35mm培養皿に播種し，24時間後に分化培地に培養液交換して分化誘導し，その3日後から電気刺激を与えた。条件検討により，分化培地としては1％程度のFBSおよび10μg/mLインスリンを含むDMEMが適切であると判断した。当年度は，電気刺激装置としてC-PaceEM，カーボン電極としてC-Dishを用いるように変更し，刺激持続時間 2.5ミリ秒，周波数 1 Hz，電圧 10～40 Vの条件にて，最大で24時間の通電で行った。
電気刺激による細胞傷害性を検討したところ，10分間の電気刺激後に40Vでは統計的に有意なダメージが検出され，30Vでもその傾向が見られた。一方，10Vあるいは20Vでは損傷はないと考えられた。さらに，10分間の電気刺激後の培養液グルコース濃度を測定すると，30V以上では有意な減少が見られ，電気刺激による筋収縮の促進が確認できた。この条件では24時間の電気刺激には耐えられない可能性を考慮し，以後の実験は10V，24時間で行った。
そして，サルコメアの一員であるα-actininの免疫蛍光染色を行うと，電気刺激後に横紋が形成されることを観察した。
前年度に，同様の条件で筋管の最大横径平均値が有意に増加し，度数分布図では大きな最大横径をもつ筋管の割合が増加したことと合わせ，培養筋細胞に電気刺激を与える実験系の構築に成功したと判断した。さらに，今後の作業効率を考え，筋分化を容易にかつ再現性良く実現するため，筋分化制御因子MyoDをテトラサイクリン誘導システムによって発現誘導させられるC2Tet-MyoD細胞を樹立した。今後はこの細胞を中心に実験を行う予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
培養筋細胞に電気刺激を与えることによって筋肥大の誘導と筋管の成熟を促進することに成功したため，筋核数を計数して電気刺激が細胞融合を促進することを明らかにする。また，同様の実験をヒト不死化未分化筋芽細胞株Hu5/KD3でも行う。
細胞融合部位を同定するための実験として，筋細胞特異的に細胞融合に関与することが報告されているmyomaker，myomixerや，筋細胞の融合前後でダイナミックな変化が起こる脂質マイクロドメイン等の免疫細胞化学液検出を行う。これらのタンパク質は通常の免疫蛍光染色法では検出が難しかったことから，TSA法を用いて傾向シグナルの増強を図ることを検討している。
さらに，細胞培養系では，筋管に対する筋芽細胞の融合部位を制限することを目的として，非接着性の基質にスポット状の接着部位を設けて細胞をアレイ状に配置することで，融合部位を一定範囲内に制限することを試みる。まず筋芽細胞同士の融合を観察するための培養を行って細胞の接着方法や細胞間の距離を調整した後に，筋管と筋芽細胞の融合を観察するための培養条件を検討する。細胞融合部位は通常の観察方法に加えて，マイクロ流体破砕を用いた細胞膜の裏側解析技術を用いて，生きたままの細胞膜の内側を観察することを試みる。
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| Causes of Carryover |
前年度に使用した電気刺激装置では十分な効果が発揮されなかったことから，本年度は異なる電気刺激装置であるC-PaceEMを導入した。この装置を用いた基本的な条件検討が主体となったため，予定よりも遅れてしまったものの，C2C12細胞に対して前年度よりも効率的に電気刺激を与え，筋収縮を誘導できること，さらには横紋形成が促進できることをあきらかにできた。そのため，研究自体は着実に進行している。次年度は，電気刺激装置に使用する電極の購入に加え，筋収縮を生化学的にモニターするための培養液中グルコース濃度，乳酸濃度を測定するための試薬，細胞のタンパク質合成量をモニターするための試薬，筋細胞融合に関与するタンパク質の抗体，遺伝子発現解析のために必要なリアルタイムPCR試薬や，ウェスタンブロット用の抗体，培養液，成長因子・サイトカイン等を購入して研究を実施する。
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