2023 Fiscal Year Research-status Report
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21K11689
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| Research Institution | Nakamura Gakuen College |
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Principal Investigator |
加藤 正樹 中村学園大学, 栄養科学部, 教授 (60444808)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
末武 勲 中村学園大学, 栄養科学部, 教授 (80304054)
田辺 賢一 中村学園大学, 栄養科学部, 准教授 (60585727)
小野 美咲 中村学園大学, 栄養科学部, 講師 (10441726)
安永 明日香 中村学園大学, 栄養科学部, 助手 (60846319) [Withdrawn]
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 非アルコール性脂肪肝炎 / 脂肪肝 / 線維化 / 細胞老化 / フィトケミカル / フィセチン / スルフォラファン / クルクミン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞レベルの実験では、フィセチン、クルクミン、スルフォラファンなどのフィトケミカルが優れた抗細胞老化活性を有していることが示された。これを基に、高脂肪食＋フルクトース水によるマウスＮＡＳＨモデルに、これらのフィトケミカルを混餌投与し、肝臓の代謝や炎症・線維化、細胞老化レベルを評価した。
フィトケミカル非添加（Ｎ）群、フィセチン0.02％添加（Ｆ）群、クルクミン0.3％添加（Ｃ）群、スルフォラファン0.015％添加（Ｓ）群のマウスを準備し、21～24週間飼育した。その後マウス肝よりmRNAを抽出し、脂質合成系（FAS, ACC1）、脂質酸化系（ＰＰＡＲα）、細胞死系（Ｂａｘ）、炎症（ＴＮＦα）、線維化（ＴＧＦβ）、細胞老化（Ｐ16，ＩＬ-6）の発現をＲＴ-ＰＣＲで評価した。この結果、Ｎ群と比較して、Ｓ群では炎症・線維化は32％・37％低下、脂質酸化は219％増大し、細胞老化は13％低下した。Ｃ群では、線維化は不変、脂質合成は48％低下、細胞死は9.1％増大、細胞老化は35％低下していた。Ｆ群では、線維化は不変、脂質合成は47％低下、細胞老化は80％低下、細胞死は12％低下していた。これらの結果から、スルフォラファンは脂質酸化の増強による脂質貯留の軽減を介した炎症・線維化抑制、クルクミンは脂質合成抑制と細胞老化抑制作用、フィセチンは脂質合成抑制と強い細胞老化抑制作用を有することが示された。
これらのフィトケミカルの肝組織における抗細胞老化活性を確認するため、細胞老化のマーカーである、p16、p21、Histon H2AX抗体により免疫染色を試みたが、再現性のある実験結果を得るには至らなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
細胞老化の出現が、NASH肝における炎症・線維化進展の強力な誘因であることを証明するために、老化細胞と炎症細胞および活性化肝星細胞の肝小葉内の空間的・時間的分布の解析が有用である。マウス肝を用いて免疫染色を行なったところ、マクロファージ（Ｆ４/80抗体）および活性化星細胞（α平滑筋抗体）は検出できたが、老化細胞の検出は困難であった。p16、p21、Histon H2AX抗体による免疫染色はいずれもバックグランドが高く、ＮＡＳＨ肝と非ＮＡＳＨ肝で明瞭な差を検出できなかった。今後、抗原賦活化や抗体濃度、ブロッキング条件など検討するとともに、新たな細胞老化マーカー分子に注目して、免疫染色による老化細胞の検出を遂行したいと考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
近年、ＤＮＡ損傷修復蛋白質53ＢＰ１（ｐ53結合蛋白質１）の検出が老化細胞で見いだされるという報告があることから、53ＢＰ１は老化細胞のマーカーとして利用できると考えられる。53ＢＰ１抗体を用いて蛍光免疫染色を行なったところ、ＮＡＳＨ肝では核内に蛍光強度の強い凝集体を有する細胞を検出することができたが、対象である正常肝ではそのような凝集体を核内にもつ細胞数は明らかに少数であった。今後、ＤＡＢ染色も含めて免疫染色の最適条件を確立するとともに、陽性細胞の定量化を目指し、各フィトケミカルの効果を比較・評価していく。
さらに、肝小葉内の門脈域（Zone 1）、中間域（Zone 2）、中心静脈域（Zone 3）への老化細胞の局在や、炎症・線維化細胞との相互関係、病理学的なNASHの特徴である風船様変性（バルーニング）した肝細胞との相互関係を解析する予定である。
これらの解析から、NASH進展機構における細胞老化の役割を明らかにすることができるとともに、抗老化活性を介したフィトケミカルによるNASH肝病態の制御方法が見いだされていくと考えている。
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| Causes of Carryover |
学部教育を中心とした研究外業務に対するエフォートの増大と、上記した免疫染色の確立が遅延したことにより、次年度使用が生じている。主に、各種抗体やブロッキング・抗原賦活化試薬の購入、肝ブロックからの切片作成などの免疫染色関連経費、RT-PCRやウエスタンブロッティングなどの分子生物・生化学関連経費、画像解析や統計解析ソフト購入経費等で使用する予定である。
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Research Products
(4 results)
