2023 Fiscal Year Research-status Report
中高齢期から始まるタンパク質品質管理システムの破綻に関する研究
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21K11710
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| Research Institution | Toho University |
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Principal Investigator |
高橋 良哉 東邦大学, 薬学部, 教授 (40197190)
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2021-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 老化 / 異常タンパク質 / プロテアソーム / タンパク質分解 / タンパク質品質管理 / プロテオスタシス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
加齢に伴いDNA、脂質、タンパク質などの生体高分子に何らかの非生理的化学修飾を伴った異常分子が蓄積する原因のひとつとして修復酵素や分解酵素などの異常があげられる。本年度は、タンパク質品質管理システムのひとつであるプロテアソーム自身の加齢に伴う異常の原因を明らかにするために、研究実施計画の（研究１）の「加齢に伴うプロテアソームサブユニットの変化」について異なる月齢のラット肝臓を用いて等電点イムノブロット解析を行った。その結果、老齢期でC2サブユニットに複数の等電点の異なるスポットが出現することを見い出した。しかし、他の調べたプロテアソームのサブユニニットには、加齢に伴う等電点変化は認められなかった。次に、老齢ラット肝臓のプロテアソームC2サブユニットの翻訳後修飾（研究2）とプロテアソームの安定性（研究3）を調べるためにプロテアソームの精製を試みた。プロテアソームC2抗体カラムを用いて老若ラット肝臓から精製した20Sプロテアソームのサブユニット構成比に有意な違いは確認できなかった。また、プロテアソーム構成サブユニットの相対比率を複数のプロテアソーム抗体の混合液を用いたイムノブロット解析でも有意な違いは認められなかった。現在、加齢で等電点の違いが認められたC2サブユニットに加え、等電点に違いがなかったN3サブユニットなどに対するポリクローナル抗体による免疫沈降法が、それぞれのサブユニットの精製と翻訳後修飾の微量分析に有用かを検討している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
COVID-19感染拡大の影響による研究の遅れは取り戻しつつある。しかし、本学部共通装置のマルチ画像解析システムが修理不能に陥り、多くの実験が約半年間にわたり遂行できない状態が続いた。具体的には、高額なマルチ画像解析システム(約3000万円)を使用したタンパク質の二次元電気泳動によるプロファイリングや特定タンパク質の修飾を同定するための正確なイムノブロット解析、さらには二次元電気泳動ゲルからのタンパク質サンプリングの作業に多大な影響がでた。これにより、特に、研究２の実験の進捗が遅れることにより、その影響で研究3も遅れている。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究実施計画の研究１に関しては、二次元イムノブロッティングによるC2プロファイリングが概ね終了することができた。次に、研究２のプロテアソームの翻訳後修飾については、質量分析による翻訳後修飾の解析を進めると共に、既知の異常翻訳修飾体（カルボニル化、AGE化、NO化、Met残基やCys残基の酸化など）の解析を特異的化学反応あるいは特異抗体を用いた反応を利用し解析を進める。研究3のプロテアソームの安定性の加齢変化に関する研究については、抗C2抗体を用いた精製条件を検討し、微量でも分析できる方法を模索し、実験を加速させる予定である。
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| Causes of Carryover |
本年度は、マルチ画像解析システムが修理不能に陥り、蛍光標識抗体を使用した二次元イムノブロット解析や酸化タンパク質の蛍光検出試薬を利用したプロテアソームの翻訳後修飾プロファイリングが行いえない状況が約半年間にわたり続いた。これにより本年度に購入を予定していた翻訳後修飾プロファイリング解析のための検出試薬や各種修飾体に対する抗体、更にはそれらの実験に必要な試薬・器具の発注を控えることになった。しかし、幸いなことに本学部予算により本年度末にマルチ画像解析システムに代わるスキャナータイプ画像解析装置（蛍光/RI、Amersham Typhoon scanner RGB System)が導入されることになった。そこで次年度は、購入を見送っていた翻訳後修飾プロファイリング解析に必要な試薬や抗体を購入し、研究の遅れを取り戻すべく実験を行う。
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Research Products
(6 results)
