2021 Fiscal Year Research-status Report

食行動の開始から終止に至る脳腸相関実行過程の時系列ライブイメージング

Research Project

Project/Area Number	21K11737
Research Institution	Soka University
Principal Investigator	根本正史創価大学, 公私立大学の部局等, その他 (80370980)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	屋嘉比康治埼玉医科大学, 医学部, 教授 (90182295) 川井秀樹創価大学, 理工学部, 教授 (90546243)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2025-03-31
Keywords	摂食行動 / 脳腸相関 / 消化管ホルモン / 視床下部 / 報酬系 / GCaMP / ライブイメージング
Outline of Annual Research Achievements	げっ歯類をモデル動物として、消化器系組織から分泌されるホルモン(グレリン、CCKなど)を末梢投与し、食欲が亢進して食行動を開始する初期過程から、さらに満腹を感知して食行動を終止するまでの一連の摂食過程において、視床下部、脳幹、大脳深部報酬系の神経核群の活動と摂食行動の動的過程をライブイメージングする。すなわち、食思に関わる情報伝達経路に関して、これに関わる多数の消化管ホルモン、神経ペプチドの相互の挙動、各神経細胞集団の活動状態、出力先である摂食行動について、時系列で計測・可視化し、脳腸相関実行過程の一部始終を描出する。初年度は、そのライブイメージング実現の為に、Ａ.具体的な実験手順の策定と機器開発、Ｂ.Ca2+感受性蛍光タンパク質(GCaMP6)を標的神経細胞集団に発現させる組換え型アデノ随伴ウィルス(rAAV)の調整を行っている。詳細は以下。Ａ_①雄マウスを適用　②free moving法を用いず、アルミニウム製plateを頭部に装着、頭部固定器に接続　③足場の作製(発泡スチロール球上で前後に歩行可能)　④食行動時、ケージから頭部固定器の指定位置まで非強制的に誘導　⑤一側上肢の特定位置への移動にあわせ給餌装置を連動化　⑥頭部固定下での食餌摂取を連合学習　⑦Open Ephys社の微小蛍光顕微鏡Miniscope V4.4を海外発注　Ｂ_①目的遺伝子を発現させるpAAVベクターとしてpAAV.Syn.GCaMP6s.WPRE.SV40を適用　②ヘルパーウィルス非使用下のrAAV調整にAAVpro Helper Free System(pAVV1-Cre, pRC1vector, pHelper)を適用　③AAVベクター産生細胞としてHEK293T細胞を適用　④抽出されたrAAVをreal-time PCR法で定量、感染実験の為に凍結保存。現在、rAAVの調整中である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 遺伝子組み換え動物を取り扱う為の実験室確保に調整が必要であった。当初，P1で計画していたが，学内の規定で，P2の実験室確保が必要になった。また，微小蛍光顕微鏡の海外発注に調整が必要であった。
Strategy for Future Research Activity	上記の問題はすでに解決しており、2022年度以後、(1)抽出されたrAAVの感染実験を行い、微小蛍光顕微鏡で神経活動に伴うGCaMP6sの蛍光強度変化を可視化する。(2) GCaMP6sを発現させた標的神経細胞集団(外側野、室傍核、中脳腹側被蓋野)にグリンレンズを導き、摂食行動と神経活動とを同時にライブイメージング。(3)消化管ホルモン(グレリン、CCK)を腹腔内投与して、ライブイメージングを行う。
Causes of Carryover	すでに記載したが，遺伝子組み換え動物を取り扱う為の実験室確保に調整が必要であった。当初，P1で計画していたが，学内の規定で，P2の実験室確保が必要になった。また，微小蛍光顕微鏡の海外発注に調整が必要であった。その為，２０２１年度での主たるコストは，rAAV調整の為の費用となった。次年度，その微小顕微鏡Miniscopeの購入(基本的に頭部装着型である為，複数台の購入も検討)を予定しており，さらに，消化管ホルモンも微量でも高コストが予想される。