2021 Fiscal Year Research-status Report
従属栄養的に硝化を行うことは微生物自身にとってどのような意義があるのか？
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21K12220
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| Research Institution | Shizuoka University |
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Principal Investigator |
藤原 健智 静岡大学, 創造科学技術大学院, 教授 (80209121)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 従属栄養硝化 / POD |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１．この研究計画を立案するための発端となった、Alcaligenes faecalisの硝化誘導時におけるpod遺伝子クラスターの活性化に関する研究成果が査読付き国際学術誌（Scientific Reports）に掲載された。
２．二種類の従属栄養硝化細菌(A. faecalis, Streptomyces rubrolavendulae)についてpod遺伝子破壊株の作成に成功した。これら破壊株を用いてメタボロム解析を行い、破壊株の細胞中に現れる代謝産物、中間産物を網羅的に分析し、それを野生株のものと比較することで、PODが関与する代謝経路、つまりPODの「真」の機能を明らかにするための準備が整った。S. rubrolavendulaeについては、pod遺伝子クラスター中のdapA遺伝子破壊にも成功している。現在は表現型の分析をまず進めており、令和４年度の学会での発表を予定している。
３．A. faecalis POD (AfPOD)の結晶構造解析を進め、酵素活性を示すマンガン結合状態の構造が得られた。高活性を示す二価鉄結合状態、および基質分子あるいは阻害剤（ピコリン酸誘導体）の結合状態での結晶構造を得るための条件検討を進めた。
４．プロテオバクテリア門細菌9種、アクチノバクテリア門細菌3種、子嚢菌Ⅰ種が持つPODについて、組み換え体を用いた機能分析を行った。ピコリン酸誘導体やその類似化合物による活性阻害実験の結果と合わせて、令和４年度の学会での発表を予定している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
二種類の従属栄養硝化細菌、A. faecalisとS. rubrolavendulaeにおいてpod遺伝子破壊株が得られたことから、表現型解析、さらにメタボロム解析を実施する条件が整ったといえる。一方、Mn結合状態のAfPODの結晶構造は得られたものの、二価鉄結合状態やピコリン酸（阻害剤）結合状態の構造は現在までのところ得られていない。しかし、好気条件の下で不安定な二価鉄結合状態のPODの結晶化を行う方策に目途が立ったこと、および別途行った分析によってより強い阻害効果を示す化合物が見出されたことから、二価鉄結合状態や阻害剤結合状態での結晶構造解析が可能になったと考えている。以上を総合し、研究開始一年目の進捗状況を「おおむね順調」と判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
二種類の従属栄養硝化細菌、A. faecalisとS.rubrolavendulaeのpod遺伝子破壊株を用いて、表現型解析、さらにメタボロム解析を行う。メタボロム分析によって破壊株の細胞中に現れる代謝産物、中間産物を網羅的に分析し、それを野生株のものと比較することで、PODが関与する代謝経路、つまりPODの「真」の機能についての手掛かりが得られるものと期待している。またAfPODの基質分子、あるいは阻害剤結合状態での結晶構造、および本来の補欠分子である二価鉄を結合した状態での結晶化と構造の解析を試みる。これに必要な嫌気チャンバーは物質構造科学研究所（つくば市）の設備を利用する。さらに、ピコリン酸誘導体やその類似化合物を用い、POD活性阻害を指標とする硝化阻害剤の探索を今年度も引き続き進めることを計画している。
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