2021 Fiscal Year Research-status Report
Cellular responses to DNA double-strand breaks caused by transcription stress
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21K12245
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| Research Institution | Kanazawa Medical University |
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Principal Investigator |
逆井 良 金沢医科大学, 医学部, 講師 (10549950)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
西 良太郎 東京工科大学, 応用生物学部, 准教授 (80446525)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | DNA二本鎖切断 / 転写ストレス / カンプトテシン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
DNA損傷の中でも特に細胞毒性の強いものがDNA二本鎖切断（DSB）であり、放射線やDNAトポイソメラーゼを標的とした抗がん剤によっても誘導される。DNAトポイソメラーゼI（Top1）の阻害剤であるカンプトテシン（CPT）は、Top1がDNAに共有結合した異常中間体（Top1のDNA-protein cross-link：Top1-DPC）を蓄積させる。Top1-DPCは転写と衝突して転写ストレスを引き起こすが、その細胞応答の解析は進んでいない。我々と他のグループにより、転写ストレス時にDSB（transcription-coupled DSB：tc-DSB）が生じることは分かっているが、tc-DSBの発生および修復機構は不明のままである。これまでの解析から、我々はRecQL5がtc-DSBの発生を抑制していることを見出しており、RecQL5に注目して研究を進めることで、tc-DSBの発生及び修復機構を解明することが本研究の目的である。
tc-DSBの発生機構としては、転写共役ヌクレオチド除去修復（TC-NER）が関わることが示唆されており、DNAヘリカーゼであるRecQL5も関与することから、転写ストレス時のDNAの二次構造がtc-DSB発生に関わる可能性が予想される。まず、TC-NERの関与を明確にするために、TC-NER因子であるCSBおよびCSAをノックダウンしたところ、TC-NERがDSB発生に関わることが確認された。また、CPTによる転写ストレスにより、CSBがユビキチン化を受けることを見出しており、TC-NERがCPTによる転写ストレス応答に関わることを強く示すものとして、論文として発表した。修復経路に関する研究としては、NHEJのDNAリガーゼであるLIG4のノックアウト細胞を作成し、修復への影響を解析しており、NHEJの関与が示唆されている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでの解析から、転写依存的な53BP1のfoci形成がTop1-DPCによる転写ストレスの評価指標となることがわかっており、TC-NER因子の関与や、NHEJによる修復の関与等の解析については、順調に進んでいる。また、ノックアウト細胞の作成においても、昨今のゲノム編集技術の向上により、大きな問題もなく作成できている。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの解析からTC-NER因子の関与が確認されたが、TC-NER関与機構をさらに詳細に解析するために、TC-NERに関与するDNAヌクレアーゼであるXPGやXPFについても解析を行う予定である。DNAヘリカーゼであるRecQL5が関与することから、DNAの二次構造がtc-DSBを引き起こす原因になっている可能性を考えている。DNA二次構造としてR-loopを考え、RNaseH1の一過性過剰発現を試みているが、現段階までに影響は確認できていない。そこで、Dox誘導性RNaseH1過剰発現細胞を樹立し、改めて解析を試みる。また、DNA二次構造の候補としてGリッチな領域で形成されるG4構造も考えられる。G4構造関与の検討として、G4構造の安定化剤を添加し、tc-DSBの発生が促進されるかどうか解析する予定である。
修復経路に関しては、LIG4ノックアウト細胞の解析から、NHEJ経路がtc-DSBの修復に関わる可能性が示唆されている。今後は、NHEJによる修復の細胞運命への影響を、感受性試験により検討する予定である。
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| Causes of Carryover |
本年度の研究は概ね順調に進んでおり、必要の実験試薬類は適宜購入していたが、年度末までにわずかな未使用金が発生した。次年度の研究費として、適切に使用予定である。
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