2022 Fiscal Year Research-status Report
透析膜を利用した新しい代謝活性化システムによるDNA付加体の形成と同定
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21K12263
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| Research Institution | National Institute of Health Sciences |
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Principal Investigator |
安井 学 国立医薬品食品衛生研究所, 変異遺伝部, 室長 (50435707)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | DNA付加体 / 代謝活性化 / 薬物代謝酵素 / S9 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
変異原性物質（4種）、ラット肝S9、核酸塩基dNの各最適濃度、およびHPLC分離条件の最適化について、様々な実験より得られたデータから反応系の条件をほぼ決定した。しかしながら、現段階において、DNA付加体と予想される候補のHPLCピーク面積は非常に小さく、収率は高くないことが分かった。そこで、各変異原性物質のDNA付加体を効率良く形成させるために、S9に含有する第Ⅱ相薬物代謝酵素（硫酸転移酵素など）を機能させるアプローチを考えた。その予備実験として、まず、簡易に実行できるin vitro小核試験法を使って、S9 mix存在下でPAPS（3'-ホスホアデノシン-5'-ホスホ硫酸）補因子を補充し、S9中の硫酸転移酵素が正しく機能するかを確認した。その際の間接変異原物質は、第Ⅰ相代謝反応後に第Ⅱ相反応で硫酸抱合体を形成するとされているアリストロキア酸を用いた。その結果、PAPS補充群の小核形成頻度は、そのPAPS非補充群のそれよりも高い遺伝毒性を示した。つまり、アリストロキア酸は、硫酸抱合体を介することで、より効率良くDNA付加体を増加させたと考えられた。今後、このアリストロキア酸のDNA付加体形成能を確認できたPAPS補充型in vitro小核試験と同じ条件下で、透析膜を使ったDNA付加体形成実験を実施する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
透析膜を利用する試験管内反応において様々な条件下で実験を実施したこと、および第Ⅰ相だけでなく第Ⅱ相薬物代謝反応を利用したアプローチで、補因子補充型のin vitro小核試験法を一部確立した。以上のことから、S9存在下における試験管内のDNA付加体形成の研究が着実に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究を進めていくと、予想以上にHPLC（PDA検出器）ではDNA付加体の形成能を検出できないオーダーであることが分かってきた。質量分析装置を利用するなどいくつか方策が考えられたが、まずは、各変異原性物質のDNA付加体を効率良く形成させるため、また、in vitro代謝系の研究推進のために、S9に含有する第Ⅱ相薬物代謝酵素（硫酸転移酵素など）を機能させるアプローチを選択した。第Ⅱ相代謝酵素がワークできる条件を明確にするために、DNA付加体形成とも相関関係にあるin vitro小核試験をエンドポイントとして使う。
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| Causes of Carryover |
研究代表者が所属する変異遺伝部は、遺伝毒性試験で使用する陽性対照物質の試薬、ラット肝S9等を有しており、それらの使用期限があるため、本研究でも一部それらを使用した。
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