2022 Fiscal Year Research-status Report
Development of highly enzymatic activity capsules immobilized microbial arsenic methyltransferase
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21K12296
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| Research Institution | University of Miyazaki |
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Principal Investigator |
宮武 宗利 宮崎大学, 工学部, 助教 (40315354)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
塩盛 弘一郎 宮崎大学, 工学部, 教授 (80235506)
松根 英樹 宮崎大学, 工学部, 准教授 (10380586)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 無機ヒ素の無毒化 / 高メチル化活性カプセル / ヒ素メチル基転移酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
毒性の高い無機ヒ素はメチル化しメチル化有機ヒ素に変換することで無毒化できる。しかし、無機ヒ素のメチル化効率の低さとコストの高さから実用化には至っていない。申請者は微生物の機能を利用して無機ヒ素をメチル化することで、それらの問題が解決できると考えた。これまでに無機ヒ素をメチル化できるヒ素メチル化細菌のヒ素メチル基転移酵素（arsM）を直接で使うことで、メチル化有機ヒ素への変換効率の向上を図ってきた。そこで本研究は、直接酵素を使う方法で問題であった酵素の耐久性を向上させるために、arsMを内包した高メチル化活性カプセルの開発を目的として実施するものである。
今回検討している酵素を内包した多孔質カプセルは、酵素溶液を内水相としてW/O/Wエマルションを調製し、有機相に含まれるモノマーを重合させてカプセル化するものである。酵素の失活を抑えるために、モノマーの重合ではLEDライトによる光重合で行う。さらに、カプセルからの酵素の漏れを少なくするために、カプセルの表面をナイロン膜で覆うように設計されている。これまでの研究では、添加したarsMの50％程度の活性しか示さなかった。そこで、arsMの代わりに市販のα-グルコシダーゼを使ってカプセルの調製方法を検討することで、カプセルの調製方法の確立を目指して実験を実施した。
これまでにカプセルの調製方法の最適化を行った結果、W/OエマルションおよびW/O/Wエマルションを再現性良く調製することができるようになった。令和4年度では、さらに新規なヒ素メチル化活性を有する微生物の探索も行い、新たに宮崎県内の土壌からヒ素メチル化細菌を分離し、ヒ素に対する特性を明らかにした。その結果、今回分離した菌株の酵素溶液を使うことで、これまでのヒ素メチル化細菌の酵素溶液を使った場合より、さらにヒ素の毒性を下げることができると期待されるものであった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
arsMを内包した高メチル化活性カプセルを開発するために、本研究では酵素を内包した多孔質カプセルの調製方法を検討してきた。これまでの研究で、arsMを内包したこのカプセルを使って無機ヒ素をメチル化有機ヒ素に変換することができたが、添加したarsMの50％程度の活性しか示さなかった。そこで令和4年度は、昨年度に引続きarsMの代わりに市販のα-グルコシダーゼを使ってカプセルの調製方法を検討することで、より高活性を有するカプセルの調製方法の確立を目指して実験を実施した。昨年度の実験結果をもとにさらに調製方法の最適化を行い、W/OエマルションおよびW/O/Wエマルションを再現性良く調製することができるようになった。しかし、W/O/Wエマルションを光重合してカプセル化するときの条件を最適化できず、再現性良くカプセルを調製することができなかった。また、調製したカプセルの酵素残存活性を高めることができなかった。
酵素の固定化に使用するarsMの酵素溶液は、高メチル化活性カプセルを調製するために出来るだけ高活性のものが必要となる。そのため、昨年度大量発現が可能な宿主大腸菌BL21に組み換え直した組み換え体大腸菌にてarsMの発現量を確認し、宿主に大腸菌DH5αを用いた時より発現量が多いことが分かった。
令和4年度は、さらに新たなヒ素メチル化活性を有する微生物の探索も行った。その結果、新たに宮崎県内の土壌からヒ素メチル化細菌Streptmyces sp. M27株を分離することができた。M27株のヒ素に対する特性を調べた結果、本菌株はメチル化された有機ヒ素化合物の割合はこれまでのヒ素メチル化細菌と同程度であったが、最も毒性の低いトリメチルアルシンオキシドの割合が最も高かった。今後、本菌株についても遺伝子組み換えを実施して、arsMの酵素溶液を調製していきたい。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和5年度は、令和4年度に出来ていなかった多孔質カプセルの調製方法の最適化を行うために、有機相や外水相の界面活性剤の添加量や重合時の撹拌速度について検討する。これにより、酵素活性を維持した多孔質カプセルの調製方法を確立することができる。この方法を用いて、arsMを内包したカプセルを調製しメチル化活性を測定する。さらに、カプセルの調製方法を修正することで、arsMを内包したカプセルのメチル化活性の向上を図っていく。
令和4年度に分離したStreptmyces sp. M27株は、これまでのヒ素メチル化細菌と同程度の割合で無機ヒ素をメチル化有機ヒ素に変換することができ、さらに変換されたメチル化有機ヒ素の中でトリメチルアルシンオキシドの割合が最も高いことが分かっている。そこで、令和5年度はM27株のarsM遺伝子を持つ組み換えプラスミドを作製し、組み換えプラスミドを宿主大腸菌BL21に形質転換し、arsM遺伝子の発現を試みる。これにより、これまでのarsMの酵素溶液より高活性の酵素溶液を調製することが可能になると考えられる。
酵素内包シリカカプセルは、糖ナノ粒子を犠牲母材に用いることで酵素とシリカ膜の間に「空間」を設け、多種多様な酵素を全く失活させずにカプセル化する方法である。そこで令和5年度はarsM内包シリカカプセルを調製しメチル化活性を測定する。これにより、酵素内包シリカカプセルがarsMに応用可能であるのかを評価する。
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| Causes of Carryover |
（理由）
令和4年度に計画していた実験が実施できなかったため。
（使用計画）
令和4年度に実施できなかった実験の消耗品として、次年度使用額分を使用する。翌年度分は令和5年度の実験計画に基づいて使用する。主に、カプセルの調製と酵素調製・反応用の試薬やガラス器具等の消耗品費として使用する予定である。
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