2021 Fiscal Year Research-status Report
Establishment of bacterial bisphenol S mineralization system involved in a novel reaction by nonylphenol monooxygenase
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21K12297
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| Research Institution | University of Hyogo |
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Principal Investigator |
武尾 正弘 兵庫県立大学, 工学研究科, 教授 (40236443)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | ビスフェノールS / ノニルフェノール / 微生物分解 / フェノールスルホン酸 / ハイドロキノン / ハイドロキノンスルホン酸 / 酸化酵素 / 固定化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、工業的に重要でありながら、内分泌撹乱（環境ホルモン）作用が疑われる、ビスフェノールS（BPS）の迅速な生物分解系を構築するために、BPSを分解できるノニルフェノール（NP）酸化酵素の遺伝子（nmoA）と同酵素の分解で生成する中間体、ハイドロキノン（HQ）、フェノールスルホン酸（PS）及びハイドロキノンスルホン酸（HQS）に対する分解遺伝子や分解菌を組み合わせて完全分解系を構築することを目的としている。
まず、nmoAを用いて、大腸菌においてNP酸化酵素をヒスチジンタグ（His-tag）融合タンパクとして大量発現させ、精製を試みた。SDS-PAGE分析において大量発現は確認できたが、細胞破砕した状態で既に活性を失っており、活性型タンパクとして精製できなかった。野生型、あるいはN末端側、C末端側のどちらにHis-tagを付与しても結果は同じであった。そこで、宿主をPseudomonas属細菌に変更したところ、細胞抽出液レベルでタンパク発現とBPS分解活性が確認できたため、ここからの酵素精製とBPS分解酵素系の再構成を進めている。
また、新たにHQS分解菌として、Delftia sp. HQS1株の分離に成功した。この菌株はPSも分解できることがわかった。そこで、この菌株にnmoAを広宿主域ベクターpBBR1MCS-2に乗せて導入し、HQS1(nmoA)株を構築した。また、HQ分解菌Pseudomonas sp. TSN1株からHQ分解遺伝子（pnpCD）を取得して、同様にHQS1株に導入し、HQS1(pnpCD)株を得た。これら組換え株によるBPSの分解が確認でき、さらにHQS1(nmoA)株は生じたHQSとPSを分解し、また、HQS1(pnpCD)株はPS,HQSに加えHQも分解した。この２種類の組換え菌で、現在、代謝物を出さない完全なBPSの分解を試みている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
NP酸化酵素について、目的の酵素精製と酵素系の再構築には至らなかったが、Pseudomonas属宿主の可溶性分画にて酵素活性の検出に成功したため、今後の酵素精製に目処がたった。また、主目的である、BPSの分解系の構築には成功しており、これから固定化細胞の利用で、どの程度分解が効率化できるかに焦点が移っている。
一方、結果の中には記入していないが、BPSを単一で分解できる真菌の取得に成功した。これは、世界で初めてのBPS分解菌であり、計画以上の成果と言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
極めて稀有な反応を触媒するNP酸化酵素の特徴づけは学問的にたいへん興味深いため、現在、本酵素の活性が検出できたPseudomonas属細菌の細胞抽出液から、本酵素の精製を試み、さらに、試験管内で酵素系を再構成し、種々のBPS誘導体に対する分解性を調べる予定である。
また、分解菌と分解遺伝子を組み合わせたBPSの分解系の構築に成功したが、そのBPS分解を効率化するため、最適な組み合わせを求め、それに基づく固定化細胞を用いて、迅速なBPS分解を達成する。
一方、予想外に、BPSを単一炭素源として増殖できる真菌を取得できたため、本菌株によるBPSの分解について詳細を検討する。
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| Causes of Carryover |
ほぼ計画に従って予算を使用したが、１万円以下の端数が出たため、無理に消化せず、次年度以降の予算とともに有効に活用すべきと判断した。
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