強酸性土壌に適応する植物生育促進菌の高濃度アルミニウム耐性戦略を探る

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K12298
• Research Institution: Nihon University
• Principal Investigator: 相澤 朋子 日本大学, 生物資源科学部, 講師 (60398849)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 浦井 誠 東京農業大学, 生命科学部, 准教授 (20398853)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: アルミニウム / 金属耐性 / リン酸可溶化 / 膜脂質

Outline of Annual Research Achievements

酸性土壌では、土壌中に多く含まれるアルミニウムがイオン化し、細胞膜、細胞壁、DNAなど生体物質へ結合することで、植物の根の伸長阻害などを引き起こす。酸性土壌のなかでも、特に強酸性を示す酸性硫酸塩土壌では、農業上の影響が深刻である。本研究では、酸性条件下で植物生育促進能のある高濃度アルミニウム耐性菌として選抜したAcidocella aluminiidurans AL46株（以下 AL46株）を用い、そのアルミニウム耐性・適応機構の一端を明らかにすることを目的とする。具体的には、 不溶性リン酸塩可溶化に関わる分子の同定を行い、アルミニウム存在下で大きく変化する細胞膜脂肪酸の詳細を明らかにするとともに、 アルミニウムの輸送に関わるトランスポーターの解析をすることで、新規なアルミニウム耐性・適応機構を見出す。これまでに、イネの生育促進能を持つ高濃度アルミニウム耐性菌として選抜したAL46株を用い、そのアルミニウム耐性・適応機構の解明を目的として、以下の実験を行っている。
【実験 1】 アルミニウム存在下での不溶性リン酸塩可溶化に関わる分子の同定：酸性、かつアルミニウム存在下で有機酸とシデロフォア様分子が生産されることを確認した。
【実験 2】 アルミニウム存在下で大きく変化する細胞膜脂肪酸の解析：アルミニウム存在下で、シクロプロパン環を含む脂肪酸の比率が大きく変化すること、これにより膜透過性が変化することを確認できた。
【実験 3】 アルミニウムの輸送に関わるトランスポーターの存在の検討：AL46が持つ2種のアンモニウムトランスポーターの解析を通じて、AL46 のもつトランスポーターを大腸菌内で発現させることが出来るようになった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

アルミニウム耐性に関与する物質（有機酸や脂肪酸など）に関する研究は順調に進展している一方、様々な生育条件におけるプロテオーム解析には作業内容の煩雑さにより、再現性の観点で手法の改良を進めたい。これまでショットガンプロテオームでは、ゲル内で酵素消化する手法を採用していた。しかし、ゲル片の大きさのわずかな差や、生育条件によるタンパク質の発現量の差などによりゲル片ごとの比較は困難であった。そのため、溶液内で酵素消化し、生じたペプチドをLCMSMS解析する手法に変更している。現在は使用する界面活性剤の種類や濃度の最適化を実施中であり、今後は複数サンプルの処理が可能になると考えている。

Strategy for Future Research Activity

本研究では、以下のような実験を計画している。
【実験 1】 アルミニウム存在下での不溶性リン酸塩可溶化に関わる分子の同定: 中性環境で不溶性リン酸塩として問題になるリン酸カルシウムは、有機酸などを生産する生物により、比較的容易に可溶化される。一方、酸性条件下で不溶性を示すリン酸アルミニウムはこれらの有機酸によっては可溶化されない。AL46株は、これら不溶性リン酸を可溶化し、コロニー周辺にクリアゾーンを形成する。このクリアゾーン形成を指標に、不溶性リン酸可溶化物質を精製しているため、さらに分析を進めたい。
【実験 2】 アルミニウム存在下で大きく変化する細胞膜脂肪酸の解析: AL46株はアルミニウム存在下で、その細胞から抽出される脂肪酸の組成が大きく変化することが、予備的試験で判明している。この脂肪酸組成の変化により、細胞膜の流動性を変え、アルミニウムの細胞内への侵入を阻止している可能性がある。同様の脂質をもつ細菌についても、並行して調査していく予定である。
【実験 3】 アルミニウムの輸送に関わるトランスポーターの存在の検討: Nrat１のホモログとなる遺伝子の検出と、AL46を用いた遺伝子組換え法の改良、同遺伝子破壊株の作成、およびアルミニウム存在下で網羅的に蛋白質を同定するショットガンプロテオーム解析を行い、アルミニウムトランスポーターの検出と同定を試みる。

Causes of Carryover

コロナ禍等によるプラスチック製品の納品の遅れなどにより、実験に必要なチップやチューブなどのプラスチック器具が入手できなかった。現在は別の器具で実施しているが、研究を効率的に進めるためにも、納品に時間が多少かかっても専用のプラスチック製品の購入を進めたい。また、未発表の成果が増えてきたため、論文投稿に向けた追試にも予算を使用したいため、昨年度の未使用分は主に物品費（消耗品）に用いる予定である。