2022 Fiscal Year Research-status Report
廃棄物を水素に ～代謝工学的ゲノム改変による高度水素生産菌の構築～
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21K12341
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| Research Institution | Chubu University |
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Principal Investigator |
宮田 茂 中部大学, 応用生物学部, 准教授 (90314913)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | Clostridium perfringens / ウェルシュ菌 / 水素 / 代謝工学 / ゲノム編集 / バイオマス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ウェルシュ菌は嫌気要求度の低い偏性嫌気性菌で、現在知られている細菌のなかで最も速い増殖速度を示す水素生産菌の一種である。本研究では、ゲノム編集によりウェルシュ菌染色体を改変し、水素生産に関わる代謝系を構成する遺伝子の欠失及び挿入により水素生産性の向上を試みた。加えて、廃棄物系バイオマスからの水素生産も目指している。昨年度、グルコース含有培地を用いた場合、ldhL、ldhD、adhEの三重欠失株が最も高い水素産生量を示すことを明らかにした。また、グリセロール含有培地では、pduCDEの欠失により、増殖がグルコース含有培地なみに改善し、水素生産量が大幅に向上することを明らかにした。
今年度は、グルコース含有培地でもグリセロール含有培地でも、効率よく増殖し、高い水素生産性を示す株の構築を目指して、上記4遺伝子を欠失させた多重欠失株を構築した。その結果、グルコース含有培地では親株と比較して増殖に大きな差はみられなかったが、予想に反してグリセロール含有培地では大きく増殖が抑制された。ガスクロマトグラフィーを用いて、代謝産物を調べた結果、pduCDE単独欠失株では、グリセロールからエタノールに代謝される割合が多かったが、四重欠失株では、酪酸に代謝される割合が多かった。そのため、酪酸合成の初発酵素遺伝子であるatoBを欠失させ、理論上、水素生産に有利な酢酸合成に代謝を変化させようと試みたが、グリセロール含有培地でもグルコース含有培地でも増殖が抑制された。アセチルCoAから酢酸に代謝する酵素の反応速度が遅いか何らかの制御機構の存在が示唆された。他のClostridium属の酢酸合成遺伝子を高発現させるために、ウェルシュ菌で機能する構成的発現系の構築に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、セルロース系バイオマスや廃食油等の未（低）利用バイオマスから効率的に水素を生産可能な菌株を構築することを目的として、ゲノム編集によりウェルシュ菌の染色体を改変し、水素生産性に及ぼす効果を明らかにすることを目指している。当初から計画どおり研究が進まないことを考慮して、各課題を並行して進めることができるように研究を計画している。
2022年度は、グルコース含有培地でもグリセロール含有培地でも、効率よく増殖し、高い水素生産性を示す株の構築を目指して、それぞれの培地でよく増殖し、高い水素生産性を示す4遺伝子を欠失させた多重欠失株を構築したが、予想に反してグリセロール含有培地での増殖が抑制された。一方で、ウェルシュ菌で機能する構成的発現系の構築に成功した。その過程で、ε毒素プロモーターの性質を明らかにした。それらのことから、全体的にはおおむね順調に進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き、水素生産量が最大になる遺伝子欠失及び補充の組合せを明らかにする。また、ウェルシュ菌で高発現するセルラーゼ／ヘミセルラーゼやリパーゼの選別と非資化性糖の代謝経路を構成する遺伝子群の遺伝子補充を行い、代謝系の付与を試みる。
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| Causes of Carryover |
予想に反してグリセロール含有培地における四重欠失株の増殖が抑制されたため、さらなる多重欠失株（最大7遺伝子）を構築し、増殖に及ぼす影響を調べた。また、結果には示していないが、これらの欠失株にグリセロール代謝系遺伝子群（2経路）を補充したが、増殖は改善しなかった。プロモーター強度に問題があると考え、当初予定のない構成的発現プロモーターの検索と発現系の構築を行った。一方で、当初計画の順番を入れかえ、2023年度に計画していたウェルシュ菌における各種セルラーゼ遺伝子の発現解析を先行させた。そのため、「次年度使用額（B-A）」が生じた。
2023年度には、当初2021年、2022年度の計画していた研究を続行するため、使用計画に大きな変更はない。
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