Fabrication of the rational design strategy for enzyme mutants to enable faster catalytic cycles

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K14474
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 森 裕太郎 国立研究開発法人理化学研究所, 環境資源科学研究センター, 研究員 (50758539)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: タンパク質工学 / 酵素変異体 / 合理的設計

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、持続可能な環境調和型社会の実現に向けて、目的化合物の生産量を向上させることを目的として、高活性な酵素変異体を合理的に開発するための設計戦略の確立を目指す。具体的には、フェニルアラニン脱アンモニア酵素 (PAL) を鋳型酵素として活性測定を行い、分子動力学シミュレーションとの比較から酵素反応速度に関わる要素の抽出とそれに基づいた高活性な変異体設計のためのルール構築を行う。特に現在、酵素と基質の間の親和力を基準として酵素反応速度パラメーターKmを向上させるような研究例は多く行われているものの、反応速度Vmaxについて基準とできる計算値・指標が存在していない。そこで本研究ではVmaxを向上させうる酵素変異体の設計指針を確立させる。
本年度は鋳型酵素PALの酵素変異体モデルを構築し、基質入り口から活性中心に至るまでの時間を算出するためのメソッドの確立を試みた。しかしながら、基質入り口から活性中心に至るまでの途中の地点で最安定となりそれ以上動かなくなってしまう、そもそも計算に時間がかかる等の課題が明らかとなった。計算法に関してはもっと改善する必要性がある。
またそれと並行して、PALの酵素活性中心を除いた部分に変異を導入した酵素変異体群を作成し、活性評価を行った。その結果、野生型と比較して0倍から最大で1.4倍程度の活性を持つPAL変異体のバリエーション獲得に成功した。今度、順次上記計算値と比較する。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究の核となるVmaxの指標となりうる基質到達時間T(ent)の算出は行えたものの、一部課題も見つかっているため、次年度はこれを改善する。
またPAL変異体での評価については既に行っており、上記算出が終わった後は、すぐさまこのデータをフィードバックできる状態にある。

Strategy for Future Research Activity

本年度は、まず基質到達時間T(ent)算出方法の改良を行う。全体的に計算量が多いことが計算時間がかかる理由であると予想されるため、基質入り口から活性中心に至るまでのアミノ酸残基のみを抽出して、計算が行えないかの検討を行う。
またそれと並行して、PAL変異体を順次作成し、変異導入を行うアミノ酸残基の拡張も試みる。
最終的に計算結果とPAL活性の比較を行い、計算ベースの酵素変異体設計から、目的の高活性変異体の獲得ができるか検討を行う。