2022 Fiscal Year Annual Research Report
DNA１分子で数nm精度のDNA編集用タンパク質結合位置特定法
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21K14511
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
東 直輝 名古屋大学, 工学研究科, 助教 (50823283)
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2021-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | DNA一分子分析 / マイクロ流路 / 超解像イメージング / タンパク質結合位置特定 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
遺伝病の治療に向けて，DNA分子の標的の塩基配列にタンパク質を結合し編集するDNA編集法が実現されてきた．しかし，タンパク質が標的以外の塩基配列に誤って結合し編集する問題が実用化の障壁となっていた．そのため，DNA編集の高精度化には，タンパク質が結合した配列位置を特定する方法が必要である．これまでのDNA分子を断片化して分析する方法では，結合位置の特定に多数のDNA分子が必要であるため，数％以下の確率で生じるタンパク質の結合位置を特定できなかった．そこで本研究では，DNA一分子のタンパク質の結合位置特定法を実現することを目的とした．
本手法の実現には，第一に，通常ランダムコイル形状であるDNA一分子を伸長・固定する必要があった．そこで，微小流路内のDNA一分子の伸長・固定を試みた．微細加工技術によって表面を修飾したガラス基板を接合した微小流路を形成した．検証用として48 kbp(bp:塩基対)のDNA分子を用いた．DNA分子の片端をガラス表面に結合させた後に，圧力流れによるせん断力によって伸長・固定させた．第二に，タンパク質はDNA分子の数十bpの配列に結合するため，結合位置を10 nm精度で特定する必要があった．そこで，超解像法を用いたタンパク質の結合位置特定を試みた．DNA分子にタンパク質を結合させた後，異なる蛍光分子で蛍光染色し，流路内で伸長・固定させた．タンパク質は検証用としてRNAポリメラーゼを用いた．タンパク質に対して，超解像法の一つである輝度分布の中心位置を特定する方法を用いて10 nm精度の位置特定を実現した．特定したタンパク質の位置は，塩基配列に基づいた理論位置と概ね一致し，本手法の有効性を示した．本手法が確立できれば，多数分子を必要とせずにDNA一分子でタンパク質の結合位置を特定できるため，DNA編集を評価する新しい手法になると考えられる．
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Research Products
(3 results)
