2022 Fiscal Year Research-status Report
水溶液中における蛍光タンパク質発色団部位の選択的赤外分光計測
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21K14592
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| Research Institution | Okayama University of Science |
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Principal Investigator |
高橋 広奈 岡山理科大学, 理学部, 講師 (00803529)
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2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 共鳴IR法 / 蛍光タンパク質 / 発色団 / 赤外スペクトル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、過渡蛍光検出赤外(TFD-IR)分光法と顕微鏡技術を組み合わせた共鳴IR法により、蛍光タンパク質発色団部位の選択的な赤外分光計測法を確立し、 発色団部位の局所的な構造解析を行うことを目的としている。
共鳴IR法を蛍光タンパク質に適用すると、可視光を用いた場合はタンパク質部位はエネルギー的に励起一重項状態に励起できないため蛍光は発生しないが、発色団部位からのみ過渡蛍光が発生する。この強度をモニターしながら、赤外光を波長掃引することで、発色団部位のみの赤外スペクトルを得られる。 本手法を用い、類似発色団を持ちながら、吸収・発光特性の異なる4つの蛍光タンパク質に対して赤外スペクトル測定を行ったところ、全ての蛍光タンパク質において発色団部位のみの赤外スペクトルを選択的に得ることに成功した。これらのスペクトルは非常に高いS/N比で発色団部位のみの赤外スペクトルを選択的に得られており、スペクトルを比較すると、ピークの現れる位置や相対強度などの構造が異なることも見出している。この違いは発色団の構造の違いを反映しており、発色団の構造が非常に近いphiYFPやmOrange、eYFPなどでは、ピークの現れる位置が殆ど同一であることがわかった。 また、ラマンスペクトルが測定されている蛍光タンパク質については、共鳴IRスペクトルにおいていくつかのバンドがラマンスペクトルに比べて増強されることも分かった。この強度パターンにはFranck-Condon因子が寄与しており、励起状態における構造変化の有無に関する議論も可能であると期待する。加えて、TFD-IR法の特徴である、振動緩和過程の観測が可能である点を利用して、いくつかのピークについては、その時間変化がどのようになるのかも観察している。今後は発色団の分子構造、電子状態の解明を目指し、測定・解析を行っていく。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
蛍光タンパク質turboGFPおよびそれと同一の発色団を持ちながら、吸収・発光特性の異なる4つの蛍光タンパク質について、共鳴IRスペクトルを測定することや、いくつかのバンドにおける振動緩和過程の観察は成功している。また、ラマンスペクトルが測定されている蛍光タンパク質については、共鳴IRスペクトルにおいていくつかのバンドがラマンスペクトルに比べ て増強されることも分かった。しかしながら、コロナ禍において、蛍光タンパク質試料の提供元への訪問などが困難であったこともあり、これらのスペクトルの 詳細な解析は現在進行中であるのが現状である。また、光路調整法の改良も行うための薄膜試料の作成を検討していたが、作成に用いるミクロトームの搬入が遅れたため、次年度以降に実施予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
非常に高いS/N比の共鳴IRスペクトルを利用し、ピーク振動数や強度パターンをもとに化学結合レベルでの分子構造解析を行う。 本手法で利用するTFD-IR分光法は従来、振動緩和現象の観測に利用されていた。振動緩和速度は、振動エネルギーの散逸の速さを示しており、周囲との相互作用 が強い場合は速く、弱い場合は遅いことから、発色団と周囲のタンパク質との相互作用の大きさを明らかにできる。いくつかのバンドについては動緩和現象を観測するが行えているため、その結合(部位)におけるタンパク質との相互作用を議論する。今後の研究において、振動緩和現象の観測を全てのバンドに対して行い、既に得られている共鳴IRスペクトルと併せて解析することで、発色団の分子構造、電子 状態および周囲との相互作用が吸収・発光特性にどのように影響するのかを明らかにする。 また、2022年度に購入したミクロトームを利用し、基準試料を作成することで、レーザーの光軸合わせ等がスムーズに行えるようになれば、計画推進がより速やかになると期待する。
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| Causes of Carryover |
コロナの影響もあり、学会・共同研究などが全てオンラインが中心となったため、機器の購入(物品費)や旅費の仕様に遅れが生じている。 2021年度に予定していたた光学部品類(消耗品)の購入等を2022年度に行う。
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