2021 Fiscal Year Research-status Report
Structural analysis of protein-ligand weak interactions through co-encapsulation into a self-assembled spherical cage
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21K14640
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
中間 貴寛 東京大学, 大学院工学系研究科(工学部), 特任助教 (30884192)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | タンパクーリガンド相互作用 / 弱い相互作用 / 自己組織化 / タンパク質 / 構造解析 / 空間捕捉 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、生命現象で重要なタンパク質ーリガンド間の弱い相互作用を解明するために、超分子球状錯体への空間捕捉を用いた新たな構造解析手法を開発する。自己組織化により組み上がる巨大中空錯体ケージにタンパクとリガンドを共包接し、空間的に閉じ込めることで弱い相互作用を強制的に発現させる。これにより従来は解析不能であったタンパク質ーリガンド相互作用を構造的に明らかにする手段の創出を目指す。
今年度は、弱い相互作用の解析のために超分子錯体ケージ内部へタンパク質とリガンドを共包接する手法を開発した。Pd(II)イオンと金属配位子の自己組織化により形成する巨大中空錯体は、配位子に接合させることで分子、タンパク質を内包することができる。そこで、タンパク質、リガンドをそれぞれ配位子に結合させる手法を検討した。タンパク質は、N末端アミノ基とホルミルピリジル基の選択的な縮合反応を用いて、系中で配位子と接合することに成功した(査読論文Chem 2021, 7, 2672-2683.)。また、生体における重要なリガンドである糖鎖に着目し、還元的アミノ化反応を用いて配位子に結合する合成スキームを確立した。それぞれタンパク質と糖鎖を接合した配位子をPd(II)イオンと自己集合させることで中空錯体ケージへ共包接を行った。錯体内部にタンパク質とリガンドである糖鎖が共に包接されたことは、1H DOSY NMRにより分子の拡散係数を算出することで確認した。以上のように、中空錯体ケージへタンパク質とリガンドを系統的に共包接する方法論を確立することができた。
さらに、包接したタンパク質と糖鎖の間の相互作用について評価を行った。糖鎖と共包接したリゾチームの酵素活性を測定すると、錯体内部での糖鎖との相互作用により活性の低下が観測された。このことから、期待通り錯体内で近接効果により、弱い相互作用を誘起することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本年度は、タンパク質ーリガンド間の弱い相互作用の解析に向けて、タンパク質とリガンドを中空錯体ケージに共包接する手法を開発することを目標として研究を進めてきた。その結果、リガンドとして特に重要な標的である糖鎖をタンパク質と共包接するためのスキームを確立することができた。さらに、次の段階である中空錯体内部での弱い相互作用の発現の実証も進めることができ、想定していた以上に研究の進展が得られたと言える。
タンパク質とリガンドを共包接するにあたって、それぞれを接合する反応点を持つ配位子の有機合成が必要となる。どちらも10段階程度を必要とする合成経路であるが、効率的な条件を見出したことで実用に足るスキームを確立することができた。特に糖鎖については、合成の最終段階で共通した反応で配位子と縮合することにより汎用性の高い合成経路となった。
評価が困難だと想定されていた弱い相互作用の誘起についても、適切な包接系の設定により酵素活性を基に定量的な議論を行うことができた。さらに、他の分析手法による評価系の開発も進めている。
現在は、タンパク質ーリガンド間の弱い相互作用の実際の解析に向けて標的の選定を進めており、タンパク質の発現にも着手した。そのため次年度からは円滑に目的とする相互作用の解析を開始できると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度は、計画していた(1)タンパク質とリガンドの共包接法の開発を達成し、(2)超分子錯体内でのタンパク質ーリガンド相互作用の解析手法の探索に着手して、一定の成果を挙げることができた。今年度は、引き続き錯体内で相互作用が誘起されていることを実証すると共に、(3) タンパク質ー小分子リガンド間の弱い相互作用の解析、さらには(4)タンパク質ー生体高分子間の弱い相互作用の解析を開始する予定である。リガンドとしては、糖鎖に焦点を当てて主にNMRを用いた構造解析を行う。 糖鎖は、タンパク質との間で多点的な弱い相互作用を生じ、免疫応答・シグナル伝達など重要な生体機構を担っている。そのため、タンパク質ーリガンドの弱い相互作用を研究する上で特に重要な標的だと言える。
今後は、糖鎖と相互作用するタンパク質群であるレクチンに着目し、レクチンと糖鎖の弱い相互作用の解析を目指す。特に、コロナウイルスなどの病理に関連するレクチンについて、糖鎖との相互作用を構造的に明らかにすることを目指す。これまでに開発したタンパク質と糖鎖の共包接手法を用いてレクチンと糖鎖を中空錯体へ共に包接する。それをNMRで解析することで、タンパク質と糖鎖がどのように相互作用しているか原子分解能で明らかにすることを目指す。
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| Causes of Carryover |
当初の計画よりも、2年次以降に装置、試薬の購入の必要があることがわかったため、本年度の予算の一部を次年度以降で使用することにした。特に構造解析を行うための備品、試薬の購入のために予算を充てる。
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