Novel chromatin dynamics analysis exploiting double strand cleavage on DNA

2023 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 21K14751
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 橋谷 文貴 名古屋大学, 物質科学国際研究センター, 助教 (30846423)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: DNA光切断 / DNA二本鎖切断 / ヌクレオソーム / クロマチンリモデリング / 2’-Se nucleotide / ニトロベンジル光保護基

Outline of Annual Research Achievements

本研究は光照射によりヌクレオソーム上のDNAに二本鎖切断を誘導し、その挙動の確認を試みるものである。二本鎖切断は致命的なDNA損傷の一つであり細胞内でこれが起こった場合、直ちにDNA複製が停止し修復系が働くことが知られている。しかし二本鎖切断部位周辺にヒストンバリアントであるH2A.Xがリン酸化されたγH2A.Xがマーカーとして集積することはわかっているものの、詳しい集積メカニズムは不明である。これはDNA修復の研究が主に細胞を用いたin vivo実験で行われているためであり、詳細なメカニズムを調べるにはin vitro実験系の構築が求められている。そこで光照射で切断を誘導できる化学修飾DNAを用意し、これを用いてヌクレオソームを再構成することで任意のタイミングで二本鎖切断を起こす実験系の確立を目指した。
光照射で切断できるDNAは2’位にセレノ基とニトロベンジル基修飾を施すことで達成した。光照射によりニトロベンジル基が外れ、活性化されたセレノ基によってDNA鎖切断が誘導される。実際の切断実験から短時間の光照射で定量的に切断反応が進行することが分かった。また元々はDNAの接着末端を形成する技術であったことから、本化学修飾を用いたプラスミド構築実験を行った。こちらに関しても光照射による鎖切断により接着末端が形成され効率的なDNA連結反応が確認できた。本修飾DNAは光照射によって任意のタイミングで二本鎖切断を起こすものである。よってin vivo実験への応用を見越して本修飾で生じた二本鎖切断が細胞内の機構によって修復されうるのかどうかをレポーターアッセイによって評価した。細胞内における鎖切断は確認できたものの、DNA切断の修復は確認できなかった。本化学修飾によって導入されたDNAの切断部位は5’リン酸化された天然の構造となる。よって修復されない原因は配列設計等にあると考えている。