分裂酵母における新規キナーゼNnk1による寿命制御機構の解明

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K14769
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 島崎 嵩史 名古屋大学, 創薬科学研究科, 助教 (50821998)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 経時寿命 / 寿命延長 / 分裂酵母

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、分裂酵母における新規寿命関連因子Nnk1による寿命制御機構の解明を目指し、解析を行っている。nnk1+遺伝子は分裂酵母の生育に必須であり、コードしているタンパク質内にはキナーゼドメインと予測される配列が存在しているが、Nnk1タンパク質の基質や生理学的機能については今のところ明らかになっていない。しかしながら過去に、新規寿命制御因子の同定を目的とした長寿命変異株のスクリーニングが行われ、nnk1+遺伝子において生じた変異（nnk1-35変異）が経時寿命の延長を引き起こすことが明らかとなっている。本研究ではこのNnk1タンパク質の標的基質および下流で機能する因子を明らかにし、Nnk1タンパク質による未知の寿命制御機構の解明を目指し、より高等な生物種の寿命制御機構の解明に寄与する可能性のある新たな知見を得ることを目的としている。
解析にあたり、まずは下流因子の探索スクリーニングに必要なnnk1高温感受性変異株の取得を試みた。当初の予定では、nnk1遺伝子の近傍にカナマイシン耐性遺伝子（kanR）を導入し、その株に対してエラープローンPCRによる変異の導入を行う予定だったが、nnk1-35変異の近傍にkanRを導入した株が顕著な高温感受性を示したため、この株にプラスミドゲノムライブラリーを導入し、スクリーニングを実施中である。リン酸化基質の同定に関しては、Nnk1タンパク質を過剰発現するプラスミドを作製後に分裂酵母に導入し、この株を用いてリン酸化プロテオミクス解析に向けての条件検討などを行なっている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

当初はnnk1高温感受性変異株の作製を試み、これが難航していたが、作製したnnk1-35-kanR変異株に顕著な高温感受性が観察され、ゲノムライブラリープラスミドを導入することでこの表現型を回復する因子のスクリーニングを進めている。現在、既にこの高温感受性を回復した株がいくつか取得されており、表現型の回復に関与する遺伝子の同定をシーケンス解析によって進めている最中である。Nnk1タンパク質のリン酸化基質の同定に関しても、当初はタグ付きのNnk1タンパク質を分裂酵母の細胞内に発現させ、プルダウンを行なう手順で実施する予定であったが、Nnk1タンパク質のプルダウンが難航したため、Nnk1タンパク質を過剰発現した際に、リン酸化レベルが上昇したタンパク質を網羅的に解析する方針に転換している。現在までに、このリン酸化プロテオミクス解析に必要なNnk1タンパク質を過剰量発現可能なプラスミドの作製に成功し、実際に分裂酵母内で過剰量発現することを確認済みである。

Strategy for Future Research Activity

今後は引き続き、ゲノムライブラリーを用いたnnk1-35-kanR変異株の温度感受性を相補する因子の取得と同定を目指す。リン酸化基質の同定に関しては、Nnk1タンパク質を過剰発現した際にコントロールと比較してリン酸化レベルが上昇しているタンパク質を、質量分析を用いて網羅的に解析する。これら2つの網羅的解析から、Nnk1タンパク質のリン酸化基質、及び下流因子を絞り込み、Nnk1タンパク質の生理学的機能や寿命制御メカニズムを明らかにする予定である。

Causes of Carryover

実施状況にも記載した通り、当初の計画通りに研究が進まず予定よりも若干遅れてしまったため。
若干の計画変更を余儀なくされたが、変更後の進捗は順調であり、研究計画の大筋には影響ないため、今後を含めた計画全体での使用額に変更はない。