2021 Fiscal Year Research-status Report
CaMKIδ経路の病態生化学：糖尿病と悪性乳がんの発症に関わる新規分子機構の解明
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21K14783
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
秋月 一駿 広島大学, 統合生命科学研究科(総), 助教 (50881299)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | CaMKIδ / Ca2+シグナル / キナーゼ / 乳がん / CaMKP / ホスファターゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
プロテインキナーゼ Iδ (CaMKIδ) は Ca2+シグナルの下流で機能する Ser/Thr キナーゼである．乳がん患者を対象とした発現プロファイリングから，CaMKIδ を含む遺伝子領域における遺伝子重複が basal-like 乳がんの発症と関連する可能性が示唆されている．この遺伝子重複は CaMKIδ の過剰発現を引き起こすと考えれられており，また CaMKIδ は がん細胞の悪性化に関わる上皮間葉転換 (EMT) を誘導することも示唆されている．しかし，CaMKIδ の生理的基質についてはあまり知られておらず，CaMKIδ がどのようなメカニズムで EMT に関わるかは全く明らかでない．CaMKIδ を標的とした悪性乳がんの予防・治療法開発のためにも CaMKIδ 経路の解明が必要である．
本研究ではまず，CaMKIδ 抗体を用いたウエスタンブロッティングにより，各種乳がん細胞における CaMKIδ の発現を調べた．その結果，CaMKIδ は basal-like 乳がん由来とされる MDA-MB-468 細胞において高発現していることが判明した．また興味深いことに，MDA-MB-468 細胞で発現する CaMKIδ は他のヒト培養細胞内で発現しているものと比べて幾分か遅く泳動された．このことから，MDA-MB-468 細胞で発現する CaMKIδ はより長いスプライスバリアントである可能性，もしくは高度なリン酸化などの翻訳後修飾を受けている可能性が示唆された．さらに乳がん細胞における CaMKI の機能解析の一環として，CaMKI を基質とするホスファターゼ CaMKP の阻害剤を MDA-MB-231 細胞に処理したところ，乳がん細胞の遊走が顕著に阻害されることが明らかになった．これらのことから，CaMKI が乳がん細胞の遊走に関与する可能性が示唆された．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
CaMKIδ は他の CaMKI アイソフォームと同様に Ca2+/カルモジュリンの結合と CaMK キナーゼによるアクチベーションループ内の Thr のリン酸化によって活性化することが知られている．そこで，細胞内 CaMKI のリン酸化レベル（活性）を評価するためにリン酸化部位特異的抗体を購入し，ウエスタンブロッティングによりリン酸化 CaMKI の検出を試みたが，購入した抗体はバックグラウンドが高く，乳がん細胞においてクリアーなリン酸化 CaMKI のバンドを検出する条件の検討に時間を要してしまった．しかし，最終的にはホスファターゼ阻害剤処理後において，リン酸化 CaMKI をクリアーに検出できる条件を決定できた．
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| Strategy for Future Research Activity |
MDA-MB-468 細胞で CaMKIδ が高発現していることが強く示唆されたが，より長い CaMKIδ スプライスバリアントもしくは高度な翻訳後修飾を受けている可能性が考えられた．そこで MDA-MB-468 細胞から CaMKIδ を免疫沈降により取得し，質量分析に供することで検証する．また，CaMKIδ をノックダウンまたはノックアウトすることにより，細胞の形態や遊走・浸潤能に影響が出るかどうか解析する．また，肝細胞における CaMKIδ と糖新生の関連を解析するにあたり，まずは CaMKIδ の過剰発現／ノックダウンによる CRTC2 への局在変化も解析する．
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| Causes of Carryover |
当初の研究計画よりも研究が遅れており，購入予定であった物品等が買えなかったため，次年度使用額が生じた．次年度は，ヒト乳腺上皮細胞 MCF-10A 細胞を用いた実験や，CaMKIδ のノックダウン，ノックアウト実験，糖新生の律速酵素の発現解析 (qRT-PCR) などを実施する予定である．これらの実験に必要な培養細胞やsiRNA，ゲノム編集キット，qRT-PCR用試薬，抗体などは比較的高価であるため，次年度使用額も併せて，これらの物品費の購入費用に充てる予定である．
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Research Products
(2 results)
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[Journal Article] CaM kinase phosphatase (CaMKP/PPM1F/POPX2) is specifically inactivated through gallate-mediated protein carbonylation2022
Author(s)
Kazutoshi Akizuki, Shun Ishikawa, Rika Obatake, Hana Ozaki, Nao Shimoda, Tatsuo Nehira, Takeshi Yamazaki, Tomoya Kinumi, Jin Osawa, Noriyuki Sueyoshi, Isamu Kameshita, Yasushi Shigeri, Atsuhiko Ishida
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Journal Title
Archives of Biochemistry and Biophysics
Volume: 720
Pages: 109170
DOI
Peer Reviewed
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