緑茶カテキン類による細胞融合と破骨細胞分化制御機構の解明

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K14815
• Research Institution: Mie University
• Principal Investigator: 栗谷 健志 三重大学, 生物資源学研究科, 助教 (10835309)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: EGCg / 細胞融合 / 破骨細胞 / カテキン類 / RAW264.7

Outline of Annual Research Achievements

本年度はエピガロカテキンガレート(EGCg)による細胞融合に関わる因子を特定することを目指し，遺伝子発現解析および細胞の融合，機能に焦点を当てて実験を行った。
破骨前駆細胞であるRAW264.7細胞にEGCgを添加し，多核化が亢進した細胞群における遺伝子発現を解析した。比較対象として薬剤未処理群あるいは破骨細胞への分化誘導を行ったRANKL/M-CSF添加群を用いた。細胞を培養用プレートに播種しα-MEM培地中で3日間培養後，RNAを抽出し遺伝子発現解析に供した。細胞融合についてはギムザ染色，蛍光顕微鏡下での核やアクチンリングの可視化を行い評価した。破骨細胞分化についてはTRAP染色，TRAP活性測定を行い評価した。
マイクロアレイによる解析，およびリアルタイムPCRにより遺伝子発現の定量を行った結果，未処理群と比較しEGCg添加群は刺激・ストレス応答関連因子の発現上昇が認められた。実施計画ではタンパク質レベルでの評価を中心に行う予定であったが，細胞レベルでの応答や細胞の形態の評価の重要性が増した。一連の解析から選別した候補因子について細胞の多核化・融合に対する影響の検討を行い，細胞融合に関与しているかどうかを評価した。また，外的環境条件の違いによる細胞融合への影響の比較，それらの応答が破骨細胞分化とは異なる経路で起こっているかどうかを検討した。本研究の目的であるEGCg添加による細胞融合に関与する因子の特定は概ね進めることができたため，論文投稿および学会発表の準備を行っている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

これまでにマイクロアレイおよびリアルタイムPCRによる遺伝子発現解析は概ね順調に完了した。優先順位が高いものについて解析を進める一方で，変動のあった遺伝子一つ一つを機能や先行研究から多核化との関連について精査した。細胞の機能や状態，タンパクの局在を明らかにするため，細胞融合の評価方法や細胞の応答を検出する手法を検討し，詳細な解析のために共焦点レーザー顕微鏡を実験系に組み込む検討を行った。細胞試験の多くは予定通り進んだ一方，共焦点レーザー顕微鏡に関しては三次元的に対象をイメージングすることができたが，実験系の確立に予定よりも時間が必要となったため一部の計画が次年度にずれ込む形となった。一連の解析の結果，EGCgによる細胞融合にストレス関連因子が影響を与えることが示唆され，タンパク質中心の実験から細胞自体の解析を行う実験に重きを置き検討を続けた。以上のような計画の修正はあったものの，目標であった細胞融合に関与する因子の特定と発表準備は進んでおり進捗自体に大きな遅れはない。

Strategy for Future Research Activity

前年度までに行った，EGCg添加により変動した遺伝子の発現解析結果および細胞の融合，機能を評価する実験から得られたデータを論文としてまとめる。今年度は直近3か月以内の論文の投稿と半年以内の学会発表の準備を進める。また，DC-STAMPの制御を受けると予想される遺伝子，DC-STAMPを制御し得る遺伝子を候補としてリガンドの探索やパスウェイの解析を進める。現時点で候補となる遺伝子の絞り込みも並行して進んでいるため，残りの研究期間で可能な限りそれらの解析を行う。

Causes of Carryover

本研究のために購入予定だった解析機器が手続きの過程で行方不明になるトラブルが生じた。それを埋め合わせ解析を進めるため共焦点レーザー顕微鏡の条件検討を行ったが，故障などが相次ぎ実験系の確立に時間がかかり，実験の一部が次年度にずれこんで費用を持ち越すこととなった。遅れを埋めるため学会発表を次年度に延期したことも差額が生じた理由の一つとして挙げられる。方向性の修正はあったが計画自体に大きな変更はなく，今後必要となる実験や論文掲載費なども想定の範囲内である。以上の理由で合算・使用することを計画している。