2021 Fiscal Year Research-status Report
卵子型エピゲノム形成におけるH3K36メチル化酵素ファミリーの機能解明
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21K15000
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| Research Institution | Gunma University |
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Principal Investigator |
佐々木 恵亮 群馬大学, 大学院医学系研究科, 助教 (10737159)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 卵 / エピジェネティクス / ヒストン修飾 / ゲノム編集 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
2021年度は、はじめにエレクトロポレーションによるマウス受精卵へのゲノム編集の実験系について見直しを行い、以前より効率的にゲノム編集個体を作出できる手法を確立できた。本計画ではゲノム編集によってノックインマウスを作出する。これまでは一本鎖DNAをドナーDNAとして受精卵に導入していたが、エレクトロポレーションによるドナーDNAの導入は胚への毒性を引き起こすという問題点を抱えていた。そこでアデノ随伴ウイルスベクターを用いた方法に切り替えたところ、胚発生を損ねることなくドナーDNAをデリバリーすることに成功した。現在は、この手法を用いてヒストンH3K36メチル化酵素ファミリーの機能を卵特異的に阻害した遺伝子改変マウスを作製中である。
また、卵形成過程の可視化を目標とした体外卵成長培養の構築も行った。10日齢雌マウスの卵巣より単離した二次卵胞を元に体外で作出した成熟卵は、産仔へと至る正常な個体発生能を示した。この結果は本培養系を開発した既報と同様のものであるため、十分なコンピテンシーを有する卵を体外で作出できたといえる。
さらに、顕微操作による二次卵胞への遺伝子導入および遺伝子導入卵胞の体外培養法も確立した。二次卵胞内卵母細胞の核にプラスミドDNAをマイクロインジェクションし、上述の体外培養を行うことで、正常な受精能を有する成熟卵を得ることに成功した。本手法は、遺伝子改変マウスの卵母細胞で起こる異常の機能回復実験として利用する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
研究開始前に自身の異動があり、それに伴う研究環境の整備に時間を要したため。現在、卵母細胞特異的に標的遺伝子を阻害する遺伝子改変マウスを作出中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
CRISPR-Cas9およびアデノ随伴ウイルスベクターを用いてH3K36メチル化酵素遺伝子を多重にノックダウンする遺伝子改変マウスを作製し、成長期卵母細胞のH3K36メチル化状態および胚発生能を検証する。ゲノム編集による作出が困難な場合は、コンベンショナルなプラスミドDNAの前核マイクロインジェクションによる手法、あるいはレンチウイルスベクターを用いた手法によって遺伝子改変マウスを作製する。H3K36メチル化の解析については、成長過程の卵母細胞を用いた次世代シークエンス解析によって卵子型エピゲノムの特徴であるH3K36me3を全ゲノムでプロファイリングする。発生能解析としては、遺伝子改変マウスの妊孕性、卵の受精能および初期胚発生能を調べる。
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| Causes of Carryover |
研究開始前に研究代表者の所属機関が異動になり、現在の所属機関における研究環境の整備に時間を要した。本研究課題への本格的な着手が遅れたため、未購入となった物品が生じた。本年度は後ろ倒しとなったものを含め、当初の計画に則った使用を予定している。
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