2021 Fiscal Year Research-status Report
第一減数分裂前期のR-loop形成制御に見る転写制御機構の雌雄差の解明
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21K15005
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
藤原 靖浩 東京大学, 定量生命科学研究所, 助教 (50793064)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | R-loop |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究はSetx欠損マウスの表現型の雌雄差を解析することで、Setxの機能、配偶子形成及び減数分裂期におけるR-loopの機能の解明が目的である。まずは解析の比較的容易な雄の解析を進める必要があるため、2021年度はSetx欠損雄マウスにおけるR-loop形成異常に関する解析を試みた。しかしながら、既存のR-loop検出方法は検出プローブの特異性や使用細胞の制限などの問題点があるため、CUT&Tag法とRNaseH1及びRNaseH2の組み換えタンパク質を用いた新たな手法の樹立を試みた。DNA/RNAハイブリッドに結合する能力があることを確認した組み替えタンパク質を大腸菌を用いて作成さらに精製し、容易に大量に得ることのできる培養細胞に反応させ、タグ抗体を用いてCUT&Tag法を行った（RNH-CUT&Tag法）。得られたDNAライブラリーを用いて、電気泳動によって得られた泳動像を確認したが、大量のゲノムDNAのコンタミがあるために正確な計測ができなかった。良好なバンドパターンを示した一部のサンプルを用いて得られたDNAライブラリーを用いて、シーケンスを行なったが良好な結果は得られなかった。そこで、より効率的にCUT&Tag法を行えるようにするために各ステップを見直すことで、ゲノムDNAコンタミネーションが無く、高い再現性でライブラリーDNA作成ができる方法の樹立を試みた。qPCRによるライブラリーDNAの定量、カラムを用いたDNA精製、細胞の固定、界面活性剤処理、タンパク質除去のためのProteaseKの必要性などを検証し改良を加えたところ、次世代シーケンサーで主に検出される300-400bp付近にバンドが検出され、それ以外のサイズのバンドはほとんど検出されなかった。したがって、本実験の結果から、各種RNaseH及びSETXを効率良く検出できる方法が確立できたといえる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
雄の解析に必要な、H4venus-tgマウスを用いた特定の精巣細胞の分画法を樹立した。これにより、純度の高いサンプルが得られることになるため、より詳細な解析が可能となった。そして、精巣細胞に遺伝子導入する際の精巣エレクトロポレーション法では、R-loop検出ができるだけの十分な効率で遺伝子導入ができないため、従来のエレクトロポレーションとソノポレーション法を組み合わせることで、精巣細胞への効率的な遺伝子導入方法が確立された。この手法を用いることで、精巣内でのin vivoでのR-loop局在解析が可能となる。さらに、これまで行ってきたエピゲノム解析手法であるCUT&Tag法では、ゲノムDNAのコンタミやシーケンスライブラリーの効率的な作成が困難などの問題があったため、各ステップの見直した改良型CUT&Tag法による高効率なエピゲノム解析手法の確立に成功した。これにより、再現性の高いエピゲノム解析が可能となった。しかし残念ながら、当初計画していたSetx欠損細胞を用いたR-loop局在解析が行える段階に至ることができなかった。そのため、本研究は概ね順調に進行していると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
2021年度に樹立した方法とSetx欠損精巣細胞を用いることで、in vivoにおけるR-loop局在解析を行う予定である。そして、Sext欠損雌細胞も用いた解析も行い、雌雄間でのSetx欠損による表現型の違いを解明していく。また、これまでに樹立した細胞の分画方法は現在技術論文としてまとめ、投稿に向け準備中である。現在、RNaseH組み換えタンパク質と、改良型CUT&Tag法を組み合わせたエピゲノム解析手法を行っているところである。さらに、精巣エレクトロソノポレーション法による精巣細胞へのRNaseH導入によって得られたサンプルも改良型CUT&Tag法を用いてin vivoのR-loop検出を試みる。そして、両方の方法から得られる結果を比較し、より効率的なR-loopの検出方法を検討し、今後のR-loop研究を進めていく予定である。
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