2022 Fiscal Year Research-status Report
リボソームストークをハブとする翻訳関連因子プールの機能動態解明
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21K15015
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| Research Institution | University of the Ryukyus |
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Principal Investigator |
今井 大達 琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 特命助教 (00866668)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 翻訳 / リボソーム / リボソームストーク / 近位依存ビオチン標識法 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究ではリボソームと翻訳因子の結合・解離サイクルを駆動するリボソームストークをハブとして形成される翻訳因子プールについて、その構成因子を明らかにする。また各因子とストークの結合・解離動態を明らかにする。2023年度は (a) コントロールとして用いるMBP 安定発現細胞の作製と (b) 近位依存ビオチン標識タンパク質の濃縮および質量分析によるビオチン標識タンパク質の同定を行った。
(a) Flp-In 293細胞を親株とし、近位依存ビオチン標識法のコントロールとして用いるMBP-uID安定発現細胞を樹立した。昨年度樹立したP0-uID発現細胞株と同様、ドキシサイクリン依存的に細胞質でMBP-uIDの発現が誘導され、ビオチン依存的に細胞中のタンパク質がビオチン標識されることを確認した。
(b) P0-uID発現細胞とMBP-uID発現細胞のそれぞれで近位依存ビオチン標識を行い、化学修飾によりトリプシン耐性をもたせたストレプトアビジンビーズを用いてビオチン標識タンパク質を濃縮後、トリプシン消化によってビオチン標識タンパク質由来のペプチドを溶出した。LC-MS/MSとMaxQuantソフトウェアを用いて、各サンプルからビオチン標識されたと予想されるタンパク質を同定した。3 biological replicatesを用いた解析から、P0-uIDで標識されたタンパク質を120種類、MBP-uIDで標識されたタンパク質を218種類同定した。P0-uIDで最も標識されたタンパク質はP0、MBP-uIDで最も標識されたタンパク質はMBPであった。P0-uIDによる近位依存ビオチン標識実験では、リボソームストークと直接結合することが知られている既存の翻訳因子がすべて検出されたことから、確立した実験手法によりリボソームストーク近傍に存在するタンパク質を同定できていることが期待された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度の終わりまでに、P0-uID発現細胞とMBP-uID発現細胞 (コントール細胞) を用いて、P0近傍えビオチン標識されるタンパク質を同定することを目標としていた。それらが達成されたため、本研究課題はおおむね順調に進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度同定したリボソームストーク近傍に存在しうるタンパク質を哺乳動物細胞発現系または大腸菌発現系を用いて発現・精製する。精製したタンパク質とリボソームストークとの親和性をマイクロスケール熱泳動法により順次解析する。
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| Causes of Carryover |
質量分析によるビオチン標識タンパク質の同定が予定よりも順調に進み、当初計画していた実験条件の検討が少なく済んだため。繰越予算は、新たに同定したタンパク質をコードするcDNAまたは合成遺伝子を購入するための費用として利用する。
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