2022 Fiscal Year Research-status Report
Structural and functional elucidation of L-type amino acid transporter under lipid environment
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21K15031
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| Research Institution | Yokohama City University |
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Principal Investigator |
李 勇燦 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 助教 (00894932)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | アミノ酸輸送体 / クライオ電子顕微鏡 / ナノディスク |
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| Outline of Annual Research Achievements |
L型アミノ酸輸送体（LAT）は、LAT1とCD98hcからなるヘテロ二量体型アミノ酸輸送体に属し、抗がん剤や脳への薬物送達の重要な標的とされている。本研究は、クライオ電子顕微鏡を用いた、脂質環境下でのLAT1の構造解析とその薬物認識機構の理解を目的としている。昨年度の成果に基づき、精製したLAT1を脂質環境を模したナノディスクに再構成し、クライオ電子顕微鏡による測定と解析を行った。この際、種々の基質・阻害剤を添加することで、それらとの複合体を形成し、化合物の結合様式を明らかにすることを目指した。これらの実験の結果、LAT1選択的、非選択的な阻害剤の各種に関して、原子モデルの構築が可能な高分解能での構造決定に成功した。
昨年度、バインダーのスクリーニングを行った結果に基づき、それらとの複合体を形成させ、クライオ電子顕微鏡による観察を行った。一部のバインダーは、おそらく結合が弱いことが原因となり、三次元再構成像中にその形を見出すことができなかった。結果として、マウス由来の抗体Fabフラグメントが最も有用であることを見出した。
LAT1のホモログであるSLC7ファミリータンパク質に関しても、クライオ電子顕微鏡を用いた構造解析を進めた。これまでに、LAT2、y+LAT1に関して、ナノディスク下で複数状態での三次元再構成およびモデルの構築に成功している。これらの結果から、輸送体を脂質環境下に再構成することで、その構造と分子機構を明らかにする土台が整った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究の開始と同時期にドイツ・マックスプランク研究所から横浜市立大学に異動したため、細胞培養、生化学実験、試料調製にかかる機器一式および実験系を再構築する必要があった。研究初年度である2021年度にそれらの環境構築を順調に行ったため、2022年度は実際に試料の測定と解析を行うことができた。その結果、主たる研究対象であるLAT1に関して、阻害剤と結合した状態の構造を決定することができている。さらにこの手法をLAT2にも適用することで、阻害剤の結合したマップを既に得ている。これまでの結果から、当初の仮説であった、「脂質環境下では界面活性剤下よりも天然に近い状態で膜タンパク質の構造解析が可能である」というアイデアの証明に近づいたと言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
LAT1に関しては、これまでに得ている阻害剤結合型の他にも、天然・非天然の輸送基質に関して構造解析を順次行う。また、立体構造から明らかとなった結合様式に基づいて、LAT1特異性を変化させた種々の化合物に関しても、構造解析を進める。また、細かな化学基の違いによる結合様式の違いを明らかにするためには、さらなる高分解能化が必要と考えられる。現在の試料にはフレキシブルな領域が残されているため、これらが高分解能化に悪影響を及ぼしている可能性がある。そこで、天然変性領域を取り除いたコンストラクトを各種探索し、バインダー等と組み合わせることで、よりリジッドな試料作製を目指す。LAT1およびLAT2、y+LAT1、b0,+ATに関しては、これまでに得られた構造的知見を基にそれぞれ論文を執筆する予定である。
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| Causes of Carryover |
2021年度より横浜市立大学生体膜ダイナミクス研究室に移り、研究を開始した。研究開始当時、基礎工事が終わっていない段階であったが、2022年度前半に概ね工事が完了した。そのため、当初購入を予定していた機器は、順次遅らせて選定と購入を進めることとしている。また実験装置類に関しては、共通機器で賄える分に関しては新規購入を見送ったが、老朽化やスペック不足が見込まれるものもいくつかあり、次年度に購入する。電子顕微鏡解析に必要な消耗品類や使用料に関しては、試料調製が順調に進んだこともあり、研究開始当初の見込みよりも多くの金額がかかると見込まれる。また、研究成果の発表に当たり、複数の論文として発表することを予定している。近年の論文掲載料の高騰を加味すると、当初想定したよりも多くの金額がかかると見込まれる。
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Research Products
(2 results)
