p300によるヌクレオソームアセチル化の構造基盤

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K15035
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 菊地 正樹 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, 研究員 (20742430)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: アセチル化酵素 / アセチル化ヒストン / p300 / ヌクレオソーム / クライオ電子顕微鏡

Outline of Annual Research Achievements

p300は、白血病をはじめとする様々ながん細胞の増殖に密接に関わっているアセチル化酵素である。p300は主に核内に存在し転写因子等をクロマチンにリクルートするコアクチベーターである。構成ドメインのブロモドメインがヒストンH4の12番目と16番目のリジンのアセチル化（H4K12acK16ac）を認識することや、アセチル化酵素ドメインがヒストンを修飾することにより転写を制御している。抗がん剤標的分子として注目されているが、ヒストンアセチル化認識・修飾の分子機構と転写制御機構など未だ不明な点が多い。本研究では、p300・転写因子・アセチル化ヌクレオソームの複合体構造を明らかにし、p300によるアセチル化認識・修飾機構の構造基盤を解明することを目的としている。p300はヒストンや転写因子の相互作用ドメインが複数存在し、それらの相互作用がアセチル化活性に影響を及ぼすことが知られている。p300によるヌクレオソームに対するアセチル化機構を明らかにするため、複数ドメイン（ブロモドメインやZZドメイン、HATドメイン等）を含むp300の昆虫細胞発現系を確立した。また、p300ブロモドメインはヒストンH4K12acK16acに対して高親和性であることが知られているため、H4K12とH4K16にアミノ酸残基部位特異的にアセチル化リジンを導入したアセチル化ヒストンを調製し、ブロモドメインの基質であるH4K12acK16acヌクレオソームの大量調製を行った。大量調製したp300とアセチル化ヌクレオソームを複合体化させ、グルタルアルデヒドで架橋する条件検討した。複合体化サンプルはクライオ電子顕微鏡によりグリッドの作製条件の最適化を行った。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

p300・アセチル化ヌクレオソーム複合体のクライオ電子顕微鏡による単粒子構造解析を行うため、グルタルアルデヒドで架橋したヌクレオソーム複合体の調製とグリッドの作製を進めてきた。複合体化サンプルのグリッドは、200kVのクライオ電子顕微鏡（Tecnai Arctica）で凍結条件を最適化した。グリッドチェックにより良好な顕微鏡写真が得られたサンプルについてはデータを測定し、4-6Åの分解能の電子密度マップが得られた。得られた電子密度マップから分子モデルのフィッティングと精密化を進めている。

Strategy for Future Research Activity

本研究の目的であるp300・アセチル化ヌクレオソーム複合体の単粒子構造解析のため、分解能向上を目的に300kVのクライオ電子顕微鏡で測定する。300kVのクライオ電子顕微鏡において、良好な顕微鏡写真が得られた場合には単粒子構造解析を行うためデータを収集する予定である。またp300とともに複合体を形成し、転写を制御しているSTAT1との複合体解析についても進める。STAT1については昆虫細胞発現系を確立し、大量調製を行う。p300・STAT1・アセチル化ヌクレオソーム複合体の調製方法を検討する予定である。

Causes of Carryover

昨年度は、クライオ電子顕微鏡観察でのグリッドの作製条件の検討が多く、クライオ電子顕微鏡測定費用や構造解析に必要な経費の計上が少なかったため、累計支出額が受領額を下回った。本年度からは、クライオ電子顕微鏡での観察が増えるため、主に測定・解析の費用やタンパク質の大量調製用として使用する予定である。