2021 Fiscal Year Research-status Report
タンパク質の過イオウ化によるシグナル伝達機構の分子基盤
Project/Area Number |
21K15038
|
Research Institution | The University of Tokyo |
Principal Investigator |
清水 隆之 東京大学, 大学院総合文化研究科, 助教 (90817214)
|
Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2023-03-31
|
Keywords | シグナル制御 / システイン修飾 / 硫化水素 / パースルフィド / 細菌 |
Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、申請者が光合成細菌から新規に同定した活性イオウ分子種(Reactive sulfur species; RSS)応答性転写因子SqrRのRSS応答機構および本細菌のRSS代謝系の解析を通じ、RSSシグナル伝達の分子機構を理解することを目指している。 本研究は、これまでに申請者が明らかにしたSqrRのRSS応答機構を踏まえて、1)細胞内のSqrRに対するRSSによる安定な修飾の種類の解明、および、2)SqrRの修飾に関わるRSSの代謝経路の決定を行うことで、RSSによるシグナル伝達の分子機構の詳細解明を試みている。SqrRはRSSによって2つの保存されたシステイン残基の間で分子内テトラスルフィド結合が形成され、標的遺伝子のオペレーター領域へのDNA結合親和性が低下することがわかっている。この修飾について、細胞内のメジャーなRSSであるグルタチオンパースルフィド(GSSH)とシステインパースルフィド(CysSSH)に着目して、in vitroおよびin vivoでの解析を行った。 既にCysSSHによって安定的な修飾を受けることが示唆されていたが、SqrRのDNA結合親和性についてもCysSSHによる影響を強く受けることがわかった。また、SqrRの修飾に関わるRSS代謝系に関して、RSS産生酵素SQRが産生するCysSSHが、SqrRの修飾に寄与するRSSの主要合成経路であることが示唆されていたが、SQRがin vitroでもCysSSH合成活性を持つことを示した。
|
Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究は、これまでに申請者が明らかにしたSqrRのRSS応答機構を踏まえて、1)細胞内のSqrRに対するRSSによる安定な修飾の種類の解明、2)SqrRの修飾に関わるRSSの代謝経路の決定の2つのアプローチによって進め、それらの成果を有機的に結びつけることで、RSSによるシグナル伝達の分子機構の詳細解明を試みている。今年度の各研究の研究状況を以下に記す。 1)細胞内のSqrRに対するRSSによる安定な修飾の種類の解明:細胞内のメジャーなRSSであるGSSHとCysSSHに対するSqrRの感受性について調べるため、大腸菌から精製したリコンビナントSqrRタンパク質を精製した。これを利用して、CysSSHとGSSHで処理した際のSqrRのDNA結合親和性を解析したところ、DNA結合親和性の低下速度がCysSSH処理の方が早いことがわかった。既に得られていた、SqrRがCysSSHに対して高い反応性を示す結果と併せて、CysSSHがSqrRの主要な制御分子であることが示唆された。 2)SqrRの修飾に関わるRSSの代謝経路の決定:SqrRによる制御機構に寄与するRSS代謝系を明らかにするために、硫化水素を酸化してRSSを産生するメジャーな酵素であるSQRに着目して解析を行った。既に、sqr欠損株の解析から、SQRの産生するCysSSHがSqrRの修飾に関わる主要なRSSであることが示唆されていた。SQRのRSS産生活性を測定するために、大腸菌で発現させたリコンビナントタンパク質を用いて酵素活性を測定した。その結果、硫化水素を基質として、電子をユビキノンあるいはメナキノンに伝達し、硫黄原子をシステインあるいはグルタチオンに転移することがわかり、CysSSHとGSSHの両方の合成活性があることがわかった。
|
Strategy for Future Research Activity |
今後も、以下の研究を構成することで、異なるアプローチによる研究成果を効率良く、有機的に結びつけることで研究の推進を図る。 1)細胞内のSqrRに対するRSSによる安定な修飾の種類の解明:SqrRはGSSHによってテトラスルフィド結合を形成することがわかっているが、CysSSHでも同様の修飾が形成されているかはわかっていない。さらに、硫化水素処理した細胞内での実際の修飾も解析できていない。そこで、CysSSH処理をしたリコンビナントSqrR、および、光合成細菌からアフィニティー精製したFLAGタグを融合したSqrRについて、質量分析によって修飾の種類を同定する。 2)SqrRの修飾に関わるRSSの代謝経路の決定:SQRがSqrRの修飾に関わるRSSの供給に寄与することは明確になったが、SQRはSqrRによって発現が誘導される。そのため、SQR発現前にSqrRの修飾を行うRSS合成経路が存在するはずである。そこで、RSS代謝の初期課程に関わる他の酵素についても、生化学的に酵素活性を測定し、RSS代謝への寄与を検証することで、より包括的なRSS代謝の理解を目指す。そのために、野生株とこれらRSS代謝関連遺伝子の欠損株について、質量分析を用いた網羅的RSS解析法によって細胞内RSSの定量を行うことで、細胞内のRSS代謝系の検証を試みる。
|
Causes of Carryover |
コロナの影響によってオンライン開催になった学会費用が余ったため、次年度使用額が生じた。次年度では、質量分析による解析で費用がかかるため、未使用額はその経費に充てることにする。
|