2022 Fiscal Year Research-status Report

Atg15によるオートファゴソーム選択的な膜分解機構の解明

Research Project

Project/Area Number	21K15045
Research Institution	Microbial Chemistry Research Foundation
Principal Investigator	丸山達朗公益財団法人微生物化学研究会, 微生物化学研究所, 上級研究員 (60795855)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Keywords	オートファジー / リパーゼ / 構造生物学
Outline of Annual Research Achievements	細胞質成分を包み込んだ脂質二重膜から成るオートファゴソームは液胞（リソソーム）と融合し、その内膜と内包物が液胞内酵素によって加水分解される。Atg15は液胞内に存在する脂質分解酵素(リパーゼ)であり、オートファゴソーム膜の分解を担うと考えられている。しかしながら、Atg15が液胞膜には作用せず、オートファゴソーム膜に対して選択的に作用するメカニズムは不明である。Atg15の膜選択的なリパーゼ活性を理解するためには、リパーゼ骨格に付随した機能的な構造領域を明らかにし、構成要素を柔軟に変更できる試験管内再構成実験にて機能解析を推進することが有効である。そこで本研究は、構造生物学的解析および試験管内再構成実験を行い、Atg15の機能発現機構を解明することを目的とした。本年度は、高精度立体構造予測を参考にして、出芽酵母由来Atg15の発現領域を検討した。構造予測によって、Atg15は脂質分解活性を有するリパーゼドメインに加えて、複数の構造領域が存在することが分かった。さらに、脂質膜結合を担うと予想される芳香族アミノ酸に富んだループ領域も存在することが分かった。これらの構造領域を保持したコンストラクトを複数作成し、発現および精製を検討した。調製したサンプルは、ゲルろ過クロマトグラフィーにて性状を解析した。また、調製したサンプルを巨大単層膜リポソームに添加して、膜動態の経時的変化を共焦点顕微鏡にて観察し、脂質膜への作用を解析した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 蛍光標識を施したサンプルの調製に難航しているが、インタクトなサンプルを用いて巨大単層膜リポソームへの作用解析に着手した。蛍光標識サンプルは、膜局在の可視化や膜結合の定量化に必要であるため、引き続き検討を進める。高精度立体構造予測に基づいて、コンストラクトを効率良くデザインすることができ、機能的な構造領域を試験管内再構成実験にて検証していく素地が整ってきた。
Strategy for Future Research Activity	構造生物学的解析および試験管内再構成実験を推進するとともに、各種変異体をデザインし、出芽酵母にそれら変異体を発現させたときの表現型を解析することで、Atg15の機能発現機構を明らかにする。