Development of simultaneous ultra-fast 3D super resolution imaging and 3D single molecule tracking microscope system

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K15058
• Research Institution: Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University
• Principal Investigator: 角山 貴昭 沖縄科学技術大学院大学, 膜協同性ユニット, ポストドクトラルスカラー (90896862)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 1分子蛍光顕微鏡法 / 3次元超解像顕微鏡法 / 神経シナプス / 神経受容体

Outline of Annual Research Achievements

本研究では超高速3D超解像イメージング技術を開発し、それを用いてシナプスの群島構造を解明することを目的としている。
本年度では、新規イメージング技術開発のための基礎的な予備実験を中心に研究を進めた。超高速3D超解像イメージング技術の概要として、まず、通常の1分子蛍光顕微鏡の検出光路にシリンドリカルレンズを挿入し、蛍光スポットの歪みからZ方向の位置情報を算出するastigmatism法を用いる。これに加え、高速で焦点移動が可能な液体レンズを光路に追加することで、多焦点を観察しながらより広いZ範囲でのイメージングを可能とする。
基礎となる実験として、astigmatism法における位置の決定精度を測定した。高精度のシリンドリカルレンズを特注し、それを検出系の光路に挿入するためのユニットを自作した。このユニットはシリンドリカルレンズと結像レンズの距離を調整することが可能で、Z位置と歪みの強さを調整することが可能である。さまざまな曲率のシリンドリカルレンズと結像レンズとの距離を検討した結果、R2000 mmのシリンドリカルレンズを結像レンズから50 mmの位置に設置することが、最も測定範囲と位置精度のバランスが良いという結論が得られた。このセッティングを用いることで、± 400 nmのZ範囲の測定が可能である。
各ポイントでの位置精度を見ていくと、焦点面において、XY方向の位置決定精度が± 25 nm、Z方向が ± 45 nm、焦点面から± 200 nmの面において、XY方向が± 30 nm、Z方向が ± 55 nm、焦点面から± 400 nmの面において、XY方向が± 40 nm、Z方向が ± 75 nm、程度となった。
必然として、焦点面からの距離が離れるほど位置の決定精度は悪くなる。この改良として、多焦点画像の特性を活かし、１つの点の位置を複数の画像から再構成する手法を検討する予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

１分子イメージングにおいて、各輝点の位置決定精度は最も重要な指標であり、これがその手法全体の性能を示していると言っても過言ではない。
2次元観察においてXY方向の位置決定精度については多くの論文で議論されており、理論的、実験的なデータが豊富であるが、3次元観察における位置決定精度についてはほとんど情報が無い。したがって、本年度は基本となる観察システムを構築し、位置決定精度を正確に測定することを目標とした。
その結果、astigmatism法を用いた観察における、さまざまな観察面でのXYZ方向の位置決定精度を正確に測定することができた。この様な定量的な評価は今までに無いものである。興味深いことに、位置決定精度はZ位置に対して、おおよそ二次関数的に低下し、Z方向の位置決定精度はXY方向のおおよそ２倍程度となるという結果が得られた。これら成果は本申請研究で開発する超高速3D超解像イメージング技術において重要な基礎情報となることに加え、他のastigmatism法を用いた観察法においても重要な示唆を与えることができる。
本年度では基本となる観察システムを構築し、その性能評価を正確に行うことができた。さらに、液体レンズをすでに購入し、それを顕微鏡システムに組み込む機構の準備も進めることができた。これらの結果から、研究はおおむね順調に進展していると判断した。

Strategy for Future Research Activity

今後の研究の推進方策として、構築した顕微鏡システムに液体レンズを組み込むことを第一目標とする。すでに液体レンズは購入済みであり、組み込みのための機構の準備も進めている途中である。
液体レンズの組み込みが完了し次第、それが光学系に及ぼす影響を測定する。すなわち、液体レンズの各波長における透過率、画像の歪みの有無などを確認する。
さらに、液体レンズの焦点調整のためのハード、ソフト両面でのシステムを構築する。液体レンズは入力したアナログ電圧に従って焦点距離を変化させることができるので、電圧 vs 焦点距離 というキャリブレーションカーブを作成し、それを他の顕微鏡システムと同期させて変化させることが可能なシステムを開発する。
また、液体レンズの性能評価も定量的に行う。すなわち、焦点移動に要する時間、静止状態での安定性、繰り返し精度などを測定する。それに並行し、多焦点の画像から１分子のXYZ 位置を決定するアルゴリズムを実装した解析ソフトの開発も行う。これにより、焦点面から遠い面での決定精度の向上を目指す。
さらに、最終的な対象である神経細胞の観察を目指した準備も進めていく。具体的には観察する分子に蛍光タグを付与した発現ベクターやウィルスの作成、それらを用いた発現系の構築を模索する。適切な発現量が１分子観察には重要であるため、これを実現する様なtransfection条件、観察が容易になるような細胞密度を確定させる予定である。

Causes of Carryover

細かい支出の調整のために僅かに助成金が余った。
これらは、また来年度の支出の調整に使用する予定である。