2021 Fiscal Year Research-status Report
Study of differentiation mechanism of A1 astrocyte regulated by primary cilia signaling
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21K15087
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| Research Institution | Nara Institute of Science and Technology |
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Principal Investigator |
鳥山 真奈美 奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 助教 (30773121)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 一次繊毛 / シグナル伝達 / 神経炎症 / ノックインマウス / 質量分析法 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究ではA1アストロサイトの一次繊毛に局在する受容体を網羅的に同定し、その分子機能の解析を通じてA1アストロサイト分化制御機構の解明を目指すことを目的とした。これまでに、一次繊毛中に局在する分子の探索およびシグナル伝達経路の解明が様々な手法を用いて行われてきた。例えば一次繊毛特異的にビオチン化酵素APEXを過剰発現させ、APEXによりビオチン化された一次繊毛局在分子を網羅的に同定する方法が報告された。しかし、この方法は免疫担当細胞のような遺伝子導入が困難な細胞には使用できず、またAPEXの過剰発現培養細胞系を用いた解析では一次繊毛局在性受容体は全く同定されなかったことから、できるだけin vivoに近い系を用いた、より良い同定法の開発が求められていた。本課題を解決するために、申請者は当該年度において、一次繊毛局在タンパク質であるArl13BのＣ末端にAPEXのcDNAを付加した遺伝子型をもつノックイン(KI)マウスを作製した。この遺伝子をホモにもつ産仔は胎生致死となることが判明したが、ヘテロではコロニー維持が可能であること、また、予想よりもかなり低かったものの、初代アストロサイトにおいて、融合タンパク質の発現がウエスタンブロット法により確認できたことから、本KIマウスを使用した一次繊毛構成分子の網羅的解明に使用できるのではないかと考え、現在解析に向けて条件検討を行っている。条件検討が終わり次第、定量質量分析法を用いて一次繊毛構成分子の同定を進める予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当該年度はKIマウスの作製まで進展させることができた。APEX融合タンパク質の発現量は想定よりも非常に低かったものの、研究ターゲットである初代アストロサイトにおいて、ウエスタンブロット法によりタンパク質発現が確認できている。現在タンパク質網羅的解析の実験条件を模索している最中ではあるが、目途が立ってきたため、このような評価とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
アストロサイトにおける一次繊毛局在性受容体の網羅的同定のために、生後7日目のAPEX KIマウスから大脳皮質由来アストロサイトを単離し、培養する。TNFα, C1q, IL-1α刺激を行うことでA1アストロサイトへ分化誘導する。対照として未刺激のA2アストロサイトを用意する。それぞれの細胞にビオチンフェノールを添加し、一次繊毛局在分子を網羅的にビオチン化する。反応終了後ビオチン化タンパク質をプルダウン法により精製し、定量質量分析法を用いてビオチン化タンパク質を網羅的に同定する。A1、A2アストロサイトでのビオチン化タンパク質の発現変動を比較し、A1アストロサイト分化に寄与すると示唆される受容体群をリスト化する。
また、前述の実験で得られた一次繊毛局在性受容体(以下 候補受容体)のin vitro生理機能解析を行う。数多くの受容体が同定されることが想定されるが、発現量比やGO解析、すでに報告されているトランスクリプトームデータとの照合によって、A1アストロサイトに特徴的な受容体を絞りこむ。候補受容体が実際に初代A1アストロサイトの一次繊毛に局在しているか否か、免疫染色法を用いて確認し、これら受容体の活性がA1アストロサイト表現型、すなわち分化能、増殖能、神経死誘導能、貪食能に及ぼす影響を解析することでA1アストロサイト分化や機能制御における候補受容体の生理機能を明らかにする。
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