2022 Fiscal Year Research-status Report
拡張不全心不全(HFpEF)における新規線維化関連因子の関与の検討
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21K15090
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
山本 正啓 熊本大学, 病院, 特任助教 (30880166)
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2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | HE4 / 線維芽細胞 / 新規線維化関連蛋白 / HFpEF / トランスレーショナル研究 / 内皮間葉転換 / 線維芽細胞の多様性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
『左室収縮能が保持された心不全(HFpEF)の進行性の線維化に着目し、Human Epididymis Protein 4 (HE4)の関与を解明し、新たなバイオマーカーおよび治療標的としての有用性を検証する』ことを本研究の目的としている。HFpEFは様々な因子が影響し、心臓の拡張障害や線維化が生じるとされる。しかし詳細な機序は未解明で有効な内科的治療さえも確立されていない。組織の線維化の過程においては内皮細胞の間葉転換や、線維芽細胞の変性および活性化がキープレイヤーとして認識されている。HE4は線維芽細胞の活性化に伴い同細胞において発現が亢進し血液中に分泌される新規線維化関連蛋白である。申請請者らはHE4が分泌因子として細胞内シグナルであるERKの活性化を介し心臓の病的線維化の進行に関わることを示した(J Am Heart Assoc. 2021)。
現在は、HFpEF患者群や重症大動脈弁狭窄症患者群を対象にHE4のバイオマーカーとしての有用性を明らかにしている(日本循環器学会. 2023)。
さらに、基礎実験にて、HFpEF病態におけるHE4の役割と心臓の進行性線維化の機序の解明に取り組んでいる。既報にあるL-NAME+高脂肪食負荷がマウスにおいてHFpEF様病態を示すことを応用し同負荷を野生型マウスに行い、HE4の関与の解明に取り組んでいる。また、HE4コンディショナルノックアウトマウスの作成は我々が先駆的に取り組んでおり、2022年3月に作成に成功し、現在解析を進めている。その他、並列して細胞実験を行っている。心臓の線維芽細胞や内皮細胞に対してHE4ノックダウンを行い線維芽細胞の分化や細胞外基質の増生、内皮間葉転換といった挙動の変化を評価している。
以上の研究を通してHFpEF病態におけるHE4の役割と心臓の進行性線維化の機序の解明に取り組んでいる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
新規線維化関連蛋白であるHE4に着目し、臨床・基礎研究を通して、HFpEFの病態解明に取り組んでいる。先述の通り、HFpEF患者や大動脈弁狭窄症を対象とした臨床研究においてHE4血中濃度が将来の心不全増悪や予後を予測することを明らかにし、全国学会で報告した。現在、論文報告の準備をすすめており、順調に進展していると考える。動物実験においては、野生型マウスを対象として先述のHFpEF負荷や、後述する別のHFpEF負荷を行い、心臓でHE4の発現量が亢進することを確認している。今後はHE4のコンディショナルノックアウトマウスに同様の負荷を行い、野生型マウスでの表現型と比較・検証することとしている。ノックアウトマウスの作成は、2022年3月に作成に成功しているが、ノックアウトマウスの解析に時間を要し、動物実験に関しては、やや遅れていると認識している。細胞実験においては、ラットの心臓の線維芽細胞や内皮細胞を用いて検証を進めている。線維芽細胞においてはTGF-βやアンギオテンシンⅡの刺激を加えたところ、線維化を示す遺伝子の発現量、線維芽細胞の分化を示す遺伝子の発現量が亢進することと同時にHE4発現量が亢進することが確認された。一方で、同細胞に対してsiRNAを用いてHE4ノックダウンを実施した際に、TGF-βレセプター1の活性化が低下したが、TGF-βレセプター2の活性化は亢進するといった結果であった。また、網羅的解析においてNotchシグナルが亢進することが示唆された。HE4が様々な経路で線維化に関わる可能性を示していると考えられる。今後はHFpEF病態において、HE4が線維化に促進的に関わるか、抑制するために上昇しているのかを明らかにしていく方針である。引き続き、臨床・基礎研究のそれぞれを検証しながら進めていく予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
ヒトを対象とした臨床研究においては、HE4値と心臓予後の関連を論文として報告する方針である。動物実験においては、先述の通りHE4のコンディショナルノックアウトマウスに複数の異なるHFpEF負荷を行い、野生型マウスでの表現型と比較・検証する。具体的にはサンプリングの際の血圧や心臓超音波検査での心機能や左室圧容量曲線による血行動態、心重量などを評価し、心臓でのHE4発現量との関連を評価する。また、心臓のメタボローム解析を通して心臓組織が低酸素・低栄養状態に陥った際に亢進するとされる嫌気性代謝が、どの程度変化・亢進しているかを評価する。その他、病理学的アプローチにより、心臓組織中へのマクロファージを始めとした炎症細胞の浸潤の程度を確認する。その後主に心臓線維芽細胞や内皮細胞をターゲットとしたプロテオーム解析を行う。これらの検討を通して心臓におけるHE4上昇の具体的な機序と、心臓組織における表現型へのHE4の関与を明らかにしていく。
細胞実験においては、今後は先のHFpEF負荷を実施したマウスの心臓から線維芽細胞や内皮細胞を単離し、線維化を示すⅠ型やⅢ型コラーゲンの遺伝子や蛋白の発現量、分化を示すαSMA・Ki-67やPAI-1、細胞分化を誘導するTGF-β・IL-6・IL-11やFGFといった各遺伝子や蛋白の発現をPCRやウエスタンブロッティングにて解析する方針である。さらに、同様の線維芽細胞や内皮細胞を培養し、HE4ノックダウンやHE4過剰発現といった様々な刺激を加えた際の線維化や内皮間葉転換に関わる遺伝子や蛋白発現量の変化を解析することで、HE4の変動に関わる機序、その結果起こり得る事象を明らかにしていく。
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| Causes of Carryover |
先述の通り、HE4のコンディショナルノックアウトマウスに同様の負荷を行い、野生型マウスでの表現型と比較・検証することとしており、2022年3月にHE4のコンディショナルノックアウトマウスの作成に成功し、解析を進めているが、ノックアウトマウスの作成に時間を要した。主に動物実験に対する使用額が必要になってくると認識している。
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