2021 Fiscal Year Research-status Report
ヒト胚発生過程を可視化する多階層幹細胞オルガノイドモデルの創出
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21K15098
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
柴田 峻 東北大学, 医学系研究科, 助教 (40885670)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | TS細胞 / ＥＳ細胞 / 子宮内膜 / 胎盤発生 / オルガノイド |
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| Outline of Annual Research Achievements |
哺乳類の中でもヒト胚は、着床後、子宮内膜に深く埋没していくユニークな特徴を示す。その間の胚発生過程では、母体との複雑かつ秩序立った相互作用が起こると考えられているが、その大部分は明らかではない。また、その分子機構の破綻が原因で、着床不全や流産を引き起こすと推測されるが、その病態の理解や治療法の開発も遅れている。その要因として、ヒト初期胚を用いる研究には倫理的な制約があるとともに、代替となる適切な研究モデルの欠如が挙げられる。最近、本研究室では世界で初めてヒト栄養膜幹（TS）細胞を樹立することに成功した。本研究では、胎児・母体双方の細胞について、細胞数や形態、時空間座標をヒト胚発生に即して培養し、段階的に混合しながら三次元培養を行い、胚-母体オルガノイドを創出する。オルガノイドモデルを創出するにあたり、胎児・母体側のモデル確立を行った。胚モデルについては、胚体系譜の細胞としてヒトES細胞を、胚体外系譜の細胞としてヒトTS細胞を用い、浮遊培養による共培養を行った。両者についてそれぞれ恒常的に蛍光タンパク質を発現する細胞株を樹立し、生きたまま凝集体形成過程や共培養過程を追跡可能にした。また、母体側のモデルとして、先行研究に基づき、複数のドナーの中絶検体組織より子宮内膜上皮オルガノイドの樹立と間質細胞の単離を行った。それぞれについて系譜マーカーの発現と母体のモデルについては、ホルモン応答能の確認を行った。また、両者の発生を促進する三次元したでの共培養条件を決定した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
（1）胚モデルの作製：着床前の胚は、胚盤胞と呼ばれる。胚盤胞は、胚に寄与する内部細胞塊（ICM）を将来胎盤になる栄養外胚葉（TE）が覆う。浮遊培養ヒトES細胞塊に、ヒトTS細胞を混合し、周囲を被覆することで、ICMとTEを模したES/TS細胞スフェロイドの作製を検討した。低吸着加工培養プレートおよびマイクロウェルを用いてES・ TS細胞の混合培養条件（細胞数、播種時期、培地・添加因子成分）の最適化を行った。通常ヒトES細胞は着床後の状態を示すに相当する「プライム型」あるが、着床前に相当するナイーブ型（樹立済）の維持培養を行い、胚盤胞様構造の作成も並行して検討し、再現可能であった。また、培養継続後もそれぞれの系譜の細胞が識別できるような蛍光タンパク質を向上的に発現する細胞株（EGFP-TS, KO-ES）も樹立した。
（2）子宮内膜オルガノイドの樹立と間質細胞の初代培養：手術摘出後のヒト子宮組織を細切・酵素処理により子宮内膜上皮および間質細胞を単離した。上皮細胞は既報を基に三次元培養に供し、複数ドナーから子宮内膜オルガノイドの樹立に成功した。また、子宮内膜オルガノイドおよび間質細胞をゲル内で混合培養し、エストロゲンおよびプロゲステロン添加による応答能をqRT-PCRおよび免疫染色にて確認した。エストロゲンに応答してPGR遺伝子の上昇や未分化マーカーSOX9の発現減弱等を確認し、適切なホルモン応答を示すことを確認した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後、ヒト胚モデル、子宮内膜オルガノイド、子宮内膜間質細胞を混合し、ゲル内にて三次元培養を行う。経時的に着床に特異な現象、特に栄養膜の浸潤・分化を確認しながら、発生を模倣できる培養条件の検討を重ねる。特に内部細胞塊の分化や栄養膜に関してはその系譜のマーカーの発現や形態的な類似度の評価を行う。また、共培養条件の検討の際は、ヒト子宮内膜の着床の窓を模した処理条件やその阻害等を行い、子宮内膜の胚受容能を機能的に評価する試験系を確立する。適切な培養条件を確立後、シングルセル解析によりモデル内細胞集団のプロファイルを行い、ヒト胚盤胞や子宮内膜組織および妊娠初期組織のデータと重ね合わせることでin vivo模倣能を確認する。さらに転写プロファイルを基に受容体-リガンド相互作用の予測を行い、着床や胚発生に重要な胚-母体間シグナル伝達経路を同定し、モデルを用いて経時的な解析を行う。
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Research Products
(3 results)
