2022 Fiscal Year Research-status Report
Understanding the molecular mechanism of development of gall
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21K15115
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
別所 奏子 (別所・上原奏子) 東北大学, 生命科学研究科, 助教 (90876624)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 虫こぶ / 寄生植物 / 生物間相互作用 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
虫こぶ形成昆虫とその宿主植物の飼育は困難であったが、富山大学の土田博士らによりマダラケシツブゾウムシ(以降マダラ)とアメリカネナシカズラ(以降 cuscuta)の飼育系が確立された。本研究ではこのマダラーcuscutaの飼育系を用いて虫こぶ形成の分子機構を明らかにすることを目指す。 昨年度までに、成虫期・幼虫期マダラのRNA-seqと3つの生育ステージにおけるcuscuta虫こぶのRNA-seqを行なった。本年度は、(1) cuscuta虫こぶの詳細な形態観察、(2) シロイヌナズナを宿主としたcuscuta虫こぶの誘導およびシロイヌナズナ形質転換体の作出、(3) マダラ卵巣のRNA-seqの3つを実施した。
(1) cuscuta虫こぶの詳細な形態観察により、虫こぶ内の幼虫の数に応じて虫こぶサイズが大きくなること、虫こぶの大部分は柔細胞に占められていること、虫こぶ成長段階により細胞分裂と細胞肥大の程度が異なることが明らかになった。また、維管束の誘導も積極的に生じている様子も観察された。(2) シロイヌナズナを宿主としたcuscuta虫こぶの誘導に成功したことから、シロイヌナズナ形質転換体の作出を行った。具体的には各種ホルモン応答マーカー遺伝子に蛍光タンパク質およびGUSをつけたコンストラクトを導入したシロイヌナズナ株の作出を行った。(3) マダラ卵巣のRNA-seqにより、卵巣特異的に発現し、分泌性シグナルを持つ新規遺伝子を約300絞り込んだ。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
昨年度までにcuscutaおよびマダラにおけるトランスクリプトーム解析を行い、虫こぶ発達の各段階における応答遺伝子群を同定した。本年度は、それらの遺伝子がどのような細胞変化、組織構築に関わっているかを明らかにするため、microCTによる三次元構築と薄切切片による組織観察により、cuscuta虫こぶ形態の詳細な観察を行った。microCTの結果、虫こぶ内の幼虫の数に応じて虫こぶサイズが大きくなること、虫こぶの大部分は柔細胞に占められていることが明らかとなった。さらに、組織切片観察から誘導初期の虫こぶでは細胞分裂が盛んに行われているものの、中期、終期になると細胞肥大が起きることが明らかとなった。この結果はトランスクリプトーム解析による遺伝子発現からも指示される。また、組織切片作成が可能になったことから、トランスクリプトーム解析で検出されたホルモン応答や花成に関わる遺伝子群のin situハイブリダイゼーション (ISH)を行うためのプローブを作成した。次年度はこのプローブを用いてISHを行う。
また、宿主植物をシロイヌナズナとしてそこに寄生させたcuscutaに虫こぶを誘導することに成功した。この系を用いることでより簡便にcuscutaへの遺伝子導入やRNAiが可能になると考えられる。
さらに、マダラの野外採集を行い所属研究室での飼育系をセットアップした。マダラは成虫の体長が2mm程度であり、計画時に予定していた虫こぶ誘導因子の生化学的な絞り込みは困難であると判断した。そこで候補因子をより絞り込むための別の方法として、卵巣におけるRNA-seqを行い（解剖は富山大学で行い、RNA抽出から解析は私が行なった）、卵巣特異的に発現する遺伝子を同定した。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は宿主植物シロイヌナズナを介したcuscuta形質転換系を用いて、cuscuta虫こぶにおける植物ホルモンの応答パターンを検出する。具体的にはDR5:GUSやTCS:GUSを用いたオーキシンやサイトカイニン応答の可視化を行い、虫こぶのどの領域で両植物ホルモンに対する応答が活性化しているかを明らかにする。また、花芽形成遺伝子群や植物ホルモンが虫こぶ誘導初期に重要であることが明らかとなったため、これらの遺伝子のdsRNAをシロイヌナズナにおいて過剰発現させ、cuscutaにおけるRNAiを行う。cuscuta RNAi体に対してマダラを接種し、虫こぶが誘導されないかを検証する。また、引き続きゾウムシRNA-seq解析により絞り込んだ虫こぶ誘導因子をクローニングしてシロイヌナズナで過剰発現させ、 cuscutaに移動して表現型変化を誘導するか検証実験を行う。
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| Causes of Carryover |
令和3年の1月から9月まで産休育休を取得し、令和3年度の研究計画で計上した研究費の使用に至らなかった。次年度においては、分子生物学実験に使用する試薬代、RA雇用費、出張費、学会参加費に使用する。
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Research Products
(6 results)
