2021 Fiscal Year Research-status Report

細胞内共生前に獲得したDnaA非依存型ゲノム複製機構とその進化的意義の解明

Research Project

Project/Area Number	21K15142
Research Institution	Shizuoka University
Principal Investigator	大林龍胆静岡大学, 理学部, 助教 (90778333)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Keywords	シアノバクテリア / DnaA / DNA複製
Outline of Annual Research Achievements	すべての生物においてゲノムの複製は個を維持する上で必須であり、細菌ではDnaAという複製開始因子が特定領域からの複製を制御している。dnaA遺伝子はほぼ全てのバクテリアに保存されていることから、このDnaAによる複製開始制御機構はバクテリアが多様化する以前に成立し、バクテリアに共通のメカニズムであると信じられてきた。一方で、多くの共生細菌や共生細菌由来のオルガネラゲノムは、dnaA遺伝子をコードしていないことが近年のゲノム解析でわかっており、共生進化過程でDnaAに依存しない複製機構へと進化したことが示唆されるが、詳細な複製機構は全く明らかとなっていない。本課題ではシアノバクテリア系統をモデルに（1）複製開始因子の同定とそこから詳細な複製開始機構に迫り、（2） DnaA非依存種においてDnaA-oriCシステムを再構築することにより、環境適応への影響などを検証し、dnaAを欠損した進化的背景に迫ることを目的に研究を進めている。（1-1）Synechococcus sp. PCC 7002をモデルにDnaAに依存しない複製開始機構の解析を進めた。複製領域をBrdUでラベルすることで複製活性の高い領域を濃縮し、複製開始点の網羅的解析を行なった。さらに、DnaBヘリカーゼは相対的に複製開始点に多く結合していることが知られているため、DnaBのChIP-seq解析も実施した。その結果、ある程度複製開始点を絞ることができた。（1-2）複製開始因子のスクリーニングトランスポゾンを用いて複製開始因子をスクリーニングするため、Tn-seq法の確立を進めた。（2）dnaAがそもそも保存されていないシアノバクテリアは形質転換系が確立していない。そのため今年度はまずこのシアノバクテリアを用いて形質転換系の構築を進めた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 昨年度までに、Synechococcus sp. PCC 7002をモデルに研究を進めてきた。詳細な複製開始機構に迫るため、まずは複製開始点の同定を試みた。その結果、ある程度の領域まで絞ることができている。こちらの解析は概ね計画通りに進んでいる。一方で、複製開始因子のスクリーニング系としてTn-seqを実施する計画であったが、系の確立に時間を要しており、こちらは多少計画より遅れている状況である。また、二年目以降の計画であった非モデルシアノバクテリアでの形質転換系にも着手することができ、いくつか条件検討を済ませた結果、次年度以降の計画も進められた。
Strategy for Future Research Activity	（1）Synechococcus sp. PCC 7002をモデルにDnaA非依存の解明を目指してきたが、昨年度の解析結果から、そもそも野生株において内在性のプラスミドが染色体へ挿入されていることが示唆された。このことから、dnaA遺伝子の必須性においても再検証をおこなっている。Synechococcus sp. PCC 7002は系統的にdnaAが保存されていないクレード内に位置し、もしDnaAが必須であった場合、dnaAを失った種との比較解析によりdnaAに代わる因子のスクリーニングを行う。近年、全オルソログの有無から、それぞれの表現型に特徴的な遺伝子を抽出できる手法が開発されている。今年度はこのような手法も用いて、複製開始候補因子のスクリーニングを目指す。（2）dnaA遺伝子が保存されていないシアノバクテリアにおける、接合伝達による形質転換系の確立を目指す。また、dnaA遺伝子を発現させた際のRNA-seq解析を行い、転写因子としての役割など、dnaAを欠損した進化的背景にも迫る計画である。
Causes of Carryover	Tn-seq解析において次世代シーケンス解析を外注する予定であったが、昨年度は条件検討のみでサンプル調整まで至っていないため、今年度シーケンス解析を実施する。