2021 Fiscal Year Research-status Report
Analyzing oligodendrocyte-neuron interaction using a rabies virus vector and AAV vectors
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21K15197
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| Research Institution | Jichi Medical University |
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Principal Investigator |
長内 康幸 自治医科大学, 医学部, 助教 (90758004)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | AAV / 狂犬病ウイルス / 遺伝子発現リーク |
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| Outline of Annual Research Achievements |
新規オリゴデンドロサイト-神経軸索同時標識法の開発において障害になるのは、意図しない遺伝子発現（リーク）である。我々はまずこのリークの原因を突き止めるため、リークの量をモニターできるベクター(CAG-lox-STOP-lox-GeneA-P2A-GeneB)を作製した。解析を行った結果、P2A配列の後ろ側(3’側)の遺伝子がリークし、5’側の遺伝子はリークしないことが分かった。GFP, mCherry, DTR, ArchTなど様々な遺伝子を試してもこの傾向は変わらず、P2Aの3'側にある遺伝子は種類に関わらずリークすることが分かった。リークを減らすための方法としてP2AベクターなどBicistronicベクターを使わず、それぞれの遺伝子を独立して発現するようなベクター（例えば CAG-lox-STOP-lox-GeneAベクターとCAG-lox-STOP-lox-GeneBベクターをmixして導入する）を使用した場合にはリークは減ることが分かった。また我々はP2A配列の直下に2つ目のlox-STOP-loxを配置したベクターを作製し、リークを劇的に減らすことに成功した。最後に我々は、一般的に使われている発現誘導型複数遺伝子発現ベクターにおいても3’側遺伝子のリークが存在することを確認し、3’側遺伝子のリークは一般的な現象であり、プロモーターの種類の関わらずリークが発生することを明らかにした。本研究の成果は今後の発展が期待されている遺伝子治療やiPS細胞などを用いた再生医療などの戦略を考える際に重要な知見になると考えられる。本研究成果は2022.4.23日にBioRxivに掲載されたdoi: https://doi.org/10.1101/2022.04.23.489261。
今回の研究で、リークの無い遺伝子発現ベクターを決定できたため、令和4年度は実際にウイルスベクターを用いてオリゴデンドロサイト-神経軸索の同時標識を行う。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
狂犬病ウイルス及びAAVを用いた手法で視覚遮断後のオリゴデンドロサイト(およびそれが形成する髄鞘)の形態変化を明らかにすることが出来た。この研究は現在論文投稿中である。
新規オリゴデンドロサイト-神経軸索同時標識法はリークにより目的の細胞種以外の細胞が標識されてしまうと失敗してしまう。本年度中に遺伝子リークの原因を特定できたため、来年度は新規オリゴデンドロサイト-神経軸索同時標識を実際に行う。
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| Strategy for Future Research Activity |
大臣確認の審査が終わり次第弱毒化狂犬病ウイルスを用いたオリゴデンドロサイト-神経軸索同時標識を試みる。将来的には自治医科大学でのウイルス作製を試みるが、予備実験では他研究所から信頼性の高い弱毒化狂犬病ウイルスの供与を受け研究をおこなう。本研究によりオリゴデンドロサイト-神経軸索同時標識法の開発が行われれば、オリゴデンドロサイトがどのように運動学習や長期学習に関わるかが明らかになる可能性が高い。
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| Causes of Carryover |
令和四年度にウイルスベクター調整用の大型遠心機を購入予定であり、その購入予算として今年度の使用金の一部を取置いた。
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[Presentation] Oligodendrocytes form normal myelin in the visual pathway when all axons are derived from deprived eyes2021
Author(s)
Yasuyuki Osanai, Batpurev Battulga, Reiji Yamazaki, Mariko Yamamoto, Tom Kouki, Megumi Yatabe, Hiroaki Mizukami, Masaki Ueno, Kenta Kobayashi, Yumiko Yoshimura, Yoshiaki Shinohara, Nobuhiko Ohno.
Organizer
神経化学会
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[Presentation] 視覚伝導路における神経活動に依存した髄鞘形成機構の解明2021
Author(s)
長内 康幸, バッツルガ バツプレブ, 山崎 礼二, 山本 真理子, 幸喜 富, 矢田部 恵, 水上 浩明, 上野 将紀, 小林 憲太, 吉村 由美子, 篠原 良章, 大野 伸彦
Organizer
日本組織細胞化学会
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