2022 Fiscal Year Research-status Report
アスパラギン残基の脱アミド化機構と脱アミド化によるタンパク質構造の変化の解析
| Project/Area Number |
21K15244
|
|---|
| Research Institution | 湘南医療大学 |
|---|
Principal Investigator |
加藤 紘一 湘南医療大学, 薬学部医療薬学科, 講師 (80814821)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
|
| Keywords | 脱アミド化 / クリスタリン / 白内障 / アスパラギン残基 / 量子化学計算 / 分子動力学シミュレーション / 非酵素的翻訳後修飾 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
アスパラギン残基の脱アミド化は側鎖の分解を引き起こすが、主鎖で同様の反応が進行するとペプチド結合の切断が起きる。この脱アミド化と切断反応の比較のため、アスパラギン残基におけるC末端側のペプチド結合切断反応について量子化学計算により解析した。この反応は、隣接残基がイソロイシン残基やプロリン残基の場合に速く進行すると言われている。が、活性化障壁は隣接残基がグリシンの場合と比較して大きく低下することはなかった。したがって、脱アミド化とペプチド結合の切断が競合した結果であると考えられた。脱アミド化がタンパク質の立体構造や凝集に及ぼす影響については、γSクリスタリンを用いて解析した。それぞれのアスパラギン残基をアスパラギン酸残基に置換することで脱アミド化模倣変異体を作製した。全ての変異体について円二色性スペクトルを用いて二次構造形成および熱安定性を調べた結果、それぞれの変異は立体構造に大きな影響を及ぼさないことが明らかとなった。この結果は、分子動力学シミュレーションにより得られた結果と一致していた。熱安定性については、N37D変異において顕著に低下することが示された。他の変異体については、野生型と比較して大きな違いが見られなかった。既報の論文と比較すると溶媒条件等により結果が変化すると考えられ、変性点のみのデータでは凝集能との直接的な関連について議論することは困難であると考えられた。凝集能については、全ての脱アミド化模倣変異体において野生型よりも凝集が促進されることが明らかとなった。その中でも、37℃ではN37D変異体において最も速く凝集が起きることが示された。一方で、Asn14およびAsn143における凝集促進作用は比較的小さかった。以上より、脱アミド化が起きた際にγScrystallinの凝集に最も影響を及ぼすアスパラギン残基を特定することができた。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
2021年度に実験室が建設されていなかった影響により、実験系に遅れが生じている。また、試薬や機器の購入に際し、大学事務の処理が遅いため、申請後半年が経過しても納入されない場合がある。これにより実験をスムーズに実施できない状況にあることが大きな原因である。現状では、複数の脱アミド化が同時に起きた場合を模倣した変異体の作製が遅れている。一方で、計算系による研究は問題なく進行している。
|
| Strategy for Future Research Activity |
脱アミド化速度に対する隣接残基の影響に関する計算化学的研究については、これまでと同様に解析を進めていく。今年度中にフェニルアラニン残基とヒスチジン残基を中心に解析を進める予定である。実験系については、複数残基の脱アミド化が凝集に及ぼす影響を調べる予定である。現状では変異体発現用プラスミドの作製を進めている。これを用いて発現系を構築し、凝集能を解析する。これと並行して、タンパク質構造上におけるアスパラギン残基の脱アミド化速度の解析を行う。計算系による解析からリン酸イオン二水素イオンが触媒として働くことが示唆れているため、リン酸緩衝液を用いてγSクリスタリンを37℃インキュベートし、MALDI-TOF MSで解析するサンプルを用意する。
|
| Causes of Carryover |
納入が遅延していることにより、実験系に遅れが生じている。現状可能な範囲で実験系を進行させているが、昨年度に申請したにもかかわらず大学事務から発注すら行われていない機器類に関して今年度に再申請する費用に充てる予定である。また、昨年度に挙げられた成果を公表するため、国際学会への参加を予定している。これらの費用として使用する計画である。
|
