2021 Fiscal Year Research-status Report
酵素変異体-蛍光基質による2価マンガンのシグナル増強型検出法
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21K15246
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| Research Institution | Kobe Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
高嶋 一平 神戸薬科大学, 薬学部, 特任助教 (50769742)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | シグナル増強 / タンパク質工学 / 酵素-基質ペア |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題では生体内で必須元素であるマンガンの挙動解析技術を確立し、本元素の未知の生体機能を解明することを目指す。その解析技術として、マンガンに結合して活性化する酵素変異体(phosphodiesterase)と本酵素特異的な蛍光性基質分子を合成し、本酵素-基質ペアによるシグナル増強型の検出方法を開発する。本酵素変異体はマンガンとニッケルを補因子としており、マンガンはμＭオーダーで酵素活性を有するのに対して、ニッケルはｍＭオーダーの高濃度で活性化するため、実質的にマンガン選択的な酵素活性のスイッチングが可能である。また本合成基質は立体的嵩高さによって内因性酵素による非特異的な応答を抑えている。一方で、本研究でのツールとなる酵素の反応性(反応速度・酵素安定性)や合成基質の光学特性(蛍光波長が短波長)に改善の余地を残しており、本年度はこれら課題の解決を目指して研究を進めてきた。
本年度は、まずタンパク質工学を行うためにサーマルサイクラーなどの購入を行って研究環境を整えたのち、遺伝子組み換えによって目的の変異体をコードするプラスミド群を調製した。さらに同時に基質合成を進めており、２－ヒドロキシフェニル置換ベンゾチアゾールを基本骨格としてベンゾチアゾールのπ共役を拡張するとともに官能基を導入して自己集合性を制御することを目指している。また長波長化での検討に必要なGaussian 16/Gauss view 5を導入してTDDFT計算による波長予測を行っている。分子設計・合成検討は未だに進捗中であるが、次年度には完了して細胞系評価へと進める予定としている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本課題でのケミカルバイオロジー研究を進めるために必要なツールとして、酵素変異体と合成基質ペアのうち、酵素変異体の調製は順調に進めているが合成基質の開発は未だ進捗中である。本年度は研究代表者の異動の関係上で研究がやや遅れていたものの、異動先の研究機関は本研究に必要な設備等が充実しており、研究加速を期待できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究代表者の異動に伴って研究環境の立ち上げが必要となる。特に東北大学では地震の関係上で設備の修理を必要としている。研究環境が整い次第に、調製したプラスミドを用いたタンパク質発現を行いつつ、リン酸化基質の合成を行っていく。上期(～９月)には一連の合成を完了するとともに評価段階へとシフトする。試験管内での評価による条件検討を行ったのちに細胞系での検討を行うため、下期（１０月～）ではトランスフェクション用のプラスミドを調製して、来年度初旬までに細胞評価系での実験結果をまとめて論文投稿を目指す。
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| Causes of Carryover |
研究代表者の異動に伴って研究計画と経費執行に大きな変更を要した。以前に所属した研究機関で執行すると、研究計画の推進に大きな不利益を生じるために新しい研究機関での経費執行および研究推進を行う。
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