2022 Fiscal Year Research-status Report
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21K15352
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| Research Institution | Saitama Medical University |
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Principal Investigator |
山本 梓司 埼玉医科大学, 保健医療学部, 講師 (70823318)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 多発性硬化症 / クプリゾン / 脱髄 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、多発性硬化症（MS）の治療薬開発を目指し、脱髄抑制効果やミエリン再生効果を持つ天然試料を探索、その有効成分から詳細なメカニズムを明らかとし、新規MS治療薬として応用することを目的としている。
MSは神経軸索を取り巻くミエリンが破壊される「脱髄」を特徴とした中枢神経系の難病である。欧米では若年成人を侵す神経疾患の中で最も多く、近年，我が国での患者数も増加傾向にある。再発、寛解を繰り返し神経症状が進行するが、有効な病態修飾を行わなければ、二次進行型に移行し、身体障害や高次脳機能障害が生じ、ベッド上臥床生活を余儀なくされる。現在承認されている治療薬は免疫機能を修飾する作用を主としているが、病態が進行した場合には効果は認められていない。そのため脱髄進行を抑制可能かつ安全性の保たれた新しい薬効を持つ治療薬が求められている。
クプリゾン（CPZ: cuprizone）誘導脱髄モデルマウスは、0.2%CPZ含有飼料でマウスを飼育することでオリゴデンドロサイト特異的細胞死を誘導し、5週間後に最も脱髄が進行し、炎症性グリア細胞の増殖、運動機能障害などを評価できる進行型MSモデルとして広く用いられている。
天然資源由来抽出物であるキノコ類や甲殻類などの生体応答調整物質（BRM：Biological response modifier）は、ガンや高血圧、生活習慣病の予防効果をもつ健康食材として知られており、安全性が確保されている。
我々はCPZマウスにBRMを経口投与し、ロータロッドを用いて運動機能障害の程度を評価、脳梁の病理切片を作成しミエリン染色によりミエリン量を評価、炎症性グリア細胞マーカーの蛋白質および遺伝子発現実験による神経炎症の評価を行い、BRMのCPZに対する治療効果を検討した。CPZ誘導脱髄を抑制可能なBRMは、経口薬として進行型MS治療に応用できる可能性が高い。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
甲殻類由来の天然試料における脱髄抑制効果の検討、および脱髄抑制メカニズムの解析実験を遂行中である。甲殻類由来の天然試料を投与したCPZマウス（5週間飼育）を作製し、脳組織を採取し、行動試験（ロータロッド試験、ビーム歩行試験、ポール試験）や病理学的解析（ミエリン染色、神経炎症関連分子の免疫染色）を用いて脱髄に対する効果を検討した。1種の天然試料（特許申請中につきXとする）に脱髄抑制効果および運動機能改善効果が確認された。CPZマウスおよびX投与CPZマウス脳を採取し、リピドミクス解析を用いて2442種類の脂質成分について検討を行ったところ、脱髄抑制により変動する数種類の極長鎖不飽和脂肪酸（ULC-PUFAs: ultra-long chain polyunsaturated fatty acids）が明らかとなった。ULC-PUFAsは炭素数30を超える脂肪酸で、生体成分としては微量であるが脳に多く存在し、ミエリンや神経などの生体膜の安定化に寄与している。また、ULC-PUFAsの変換酵素に変異を持つ患者やノックアウトマウスは神経変性、小脳の発達不全、運動障害を引き起こすことが報告されている。従って、我々が検出したULC-PUFAsは、脱髄抑制の要となる活性成分である可能性が高い。
現在、Xに特異的なULC-PUFAsについてCPZモデルに単独投与し、行動解析、病理学的解析、生化学的解析を用いて脱髄抑制効果および運動障害改善効果を有するかどうか検討中である。脱髄抑制効果が認められたULC-PUFAsは、進行型MSの治療薬として応用の可能性が高い。
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| Strategy for Future Research Activity |
脱髄抑制効果が認められたULC-PUFAsは、GeneChip解析やLC-MS/MSを用いて薬理学的作用点解析（特異的な受容体、結合タンパク質、シグナル伝達経路の特定）を行い、脱髄抑制の詳細なメカニズムを明らかとする。
薬理学的作用点が明らかとなれば、ゲノム編集技術を用いて遺伝子ノックアウトマウスを作製し、行動試験、病理学的解析、生化学的解析を用いて脱髄の評価を行う。
また、CPZモデルはCPZ餌の除去により再ミエリン化が生じるため、再ミエリン化の評価モデルとしても広く用いられている。CPZ5週間後にCPZ餌を除去し、ULC-PUFAsを1週間投与したマウスを作製し、行動試験、病理学的解析、生化学的解析を用いて再ミエリン化の評価を行う。マウス脳のリピドミクス解析を行い、ミエリン再生時の脂質の変動についても検討する。
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| Causes of Carryover |
本年度は、甲殻類由来の天然試料に脱髄抑制効果を有すること、リピドミクス解析により脱髄抑制により変動する数種類の極長鎖不飽和脂肪酸（ULC-PUFAs）が明らかとなった。我々が検出したULC-PUFAsは、脱髄抑制の要となる活性成分である可能性が高い。
現在、ULC-PUFAsを購入し、CPZマウスに経口投与し脱髄抑制効果を証明する実験を進行中である。しかし、ULC-PUFAsは生成が難しいため、販売されているものは一部でありかつ高額である。さらに国際物流の停滞により、試薬の入手が困難な状況にあり、発注申請から納品まで時間がかかり、実験を進めることができない状況であった。
また、本研究は6週間以上長期に実験動物の飼育を行う（馴化期間1週間、脱髄モデル作製5週間）。飼育スペースの独占を避けるため1ケージN数を5匹程度として飼育しているが、N数確保のために約3回実験を行うため、データ解析まで時間がかかる。動物実験は本学実験動物部門の承認を得て、保健医療学部動物実験施設で行っている。
従って、実験試薬の入手困難および飼育スペース確保に時間を要することにより次年度使用額が生じた。現在、ULC-PUFAsを投与したマウス脳の採取が完了し、脱髄抑制効果を確認中である。当初の研究実施計画通り進行中である。
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