2021 Fiscal Year Research-status Report
COL6欠損によるウルリッヒ型筋ジストロフィーの病態発生のメカニズム解明研究
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21K15418
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
竹中 菜々 京都大学, iPS細胞研究所, 特定研究員 (20792849)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | iPS細胞 / ウルリッヒ型先天性筋ジストロフィー / 6型コラーゲン / 病態メカニズム / プロテオミクス解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
6型コラーゲン（COL6）の欠損はウルリッヒ型先天性筋ジストロフィー (UCMD)等の筋疾患の原因となる事が分かっている。しかしながら、UCMDに対する有効な治療法は無く、病態メカニズムも分かっていない。申請者はこれまで、UCMDモデルマウスに対し、健常者由来ヒトiPS細胞から作製されたMSC (iMSC)の移植実験を実施し、生着したiMSCによりCOL6が補充された領域において、再生筋の成熟が促進される事を確認した。さらに、COL6A1ノックアウト(KO)-iPS細胞から作製したMSC（KO-iMSC）の移植実験では、成熟化促進作用が確認されなかったため、これらの効果はiMSCにより分泌されたCOL6を介したものであると証明した。さらに、iMSCとKO-iMSCを用いてin vitroでの比較検証を行った結果、iMSCから産生されるCOL6が、筋幹細胞の増殖・分化および筋管の成熟に関連した遺伝子群の発現を上昇させる働きを持つ事を明らかにした。しかしながら、細胞外に存在するCOL6がどのようにして筋細胞膜の内側にシグナルを伝えているのかは不明である。そこで本研究では、COL6が関与するシグナル伝達系の全貌を明らかにするために、プロテオーム解析により候補分子を探索し、ノックダウン実験により責任分子の同定を目指す。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当該研究では、3つの網羅的解析（①RNA-seq解析、②リン酸化プロテオーム解析、③網羅的結合タンパク解析）により、COL6レセプター候補分子を絞り込み、さらに、それらの候補分子をKDできるように作製したdCas9-inducible KD COL6A1KO-iPSCから筋幹細胞を分化誘導し、作製されたdKD/COL6KO-iPS由来筋幹細胞と、iMSCとの共培養実験により、COL6が筋細胞に結合するレセプターとシグナル伝達系を明らかとする。
2021年度 ⇒候補分子の絞り込みを目的とした3つの網羅的解析実験のうち、リン酸化プロテオーム解析と、網羅的結合タンパク解析を実施した。②リン酸化プロテオーム解析：UCMDモデルにiMSCとKO-iMSCをそれぞれ移植したサンプルを採取し、それぞれに対してリン酸化プロテオーム解析を実施した。今後、得られたデータを詳細に解析し、iMSC移植時にリン酸化が亢進するタンパク質群を明らかとする。③網羅的結合タンパク解析：UCMDモデルに由来する筋細胞とiMSCとを共培養したのちに、COL6に対する抗体で共免疫沈降を実施し、COL6との相互作用タンパク質を網羅的に解析した。この解析により得られたタンパク質群が、COL6のレセプター候補群となる。
2021年度中に実施予定であった①のRNA-seq解析については未実施であるが、2022年度前半には実施完了予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
2022年度 ⇒ ①RNA-seq解析：UCMDモデルに由来する筋幹細胞を、iMSCかKO-iMSCそれぞれと共培養し、それぞれの筋幹細胞で発現している遺伝子群を比較し、iMSCとの共培養時（COL6の存在下）に高く発現している遺伝子群をピックアップする。2021年度に実施した③網羅的結合タンパク解析で絞り込まれたの候補群の中でも、①と②の網羅的解析で高い発現が見られた下流シグナル経路と関連性の高いレセプタータンパクが、COL6レセプター候補分子として絞り込まれる。
その後、3つの網羅的解析によって絞り込まれたいくつかのレセプター候補分子を抑制するため、それぞれの候補分子について、正確に発現を抑制できるguide RNAの設計を実施する。dKD/COL6KO-iPS由来筋幹細胞(2022度前半で準備完了予定)に対してguide RNAを導入し、実際に、ターゲット分子のKDが効率よく実施されることを確認する。さらにその実験と並行して、候補分子をHEK293Tに強制発現させ、COL6添加で下流シグナルの増強効果が認められるかを確認する実験も計画している。
2023年度 ⇒ 絞り込まれた候補分子が、実際にCOL6のシグナル伝達に関与しているかどうかを検証する実験を実施する。具体的には、dKD/COL6KO-iPS由来筋幹細胞と、iMSCの共培養実験を介して検証する。候補分子をフェーズごとにわけてKDした培養条件（Dox+）と、KDしない培養条件（Dox-）とで比較することでその分子の作用を時期特異的に解明することができる。
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Research Products
(2 results)
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[Journal Article] Collagen-VI supplementation by cell transplantation improves muscle regeneration in Ullrich congenital muscular dystrophy model mice2021
Author(s)
Takenaka-Ninagawa N, Kim J, Zhao M, Sato M, Jonouchi T, Goto M, Yoshioka CKB, Ikeda R, Harada A, Sato T, Ikeya M, Uezumi A, Nakatani M, Noguchi S, Sakurai H.
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Journal Title
Stem cell research & therapy
Volume: 12
Pages: 446-463
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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