2021 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of the role of the increase of interstitial pressure on the pathophysiology of lung cancer and the development of novel treatment
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21K15513
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University of Medicine |
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Principal Investigator |
徳田 深作 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (00433277)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 肺癌 / 間質圧 / 細胞極性 / 腫瘍微小環境 / PKA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ほとんどの癌組織において間質圧の上昇が認められるが、間質側からの物理的な圧力が癌の病態に果たす役割について調べた報告はほとんどない。本研究では肺癌細胞を用いて間質側からの圧力が及ぼす影響を明らかにし、新たな治療法を開拓することを目的としている。
物理的な圧力が及ぼす影響について検討するためEGFR変異肺癌細胞をフィルター膜に培養して管腔側と基底側の培地の量を変えることによって圧を加えたところ、基底側からの圧によって上皮の重層化が引き起こされた。上皮の重層化は経時的に進行したが、基底側からの圧をなくすと上皮は単層に戻ることが確認された。
次に重層化した上皮を透過型電子顕微鏡で観察したところ、重層化内部に腔が観察され腔の表面に微絨毛が形成される極性異常が認められた。肺癌の手術検体においても重層化した腫瘍の内部に微絨毛を伴う腔形成が認められ、生体内でも同様の極性異常が生じていることが確認された。さらにBrdU assayを用いて細胞増殖への影響を検討したところ、基底側から圧を加えた条件ではBrdU陽性細胞が増加しており基底側からの圧によって細胞周期が亢進すると考えられた。
基底側からの圧によって上皮が重層化するメカニズムを検討するため細胞内シグナルへの影響を検討したところ、EGFR経路の下流のRas/Raf/MEK経路やPI3K/Akt/mTOR経路の活性には変化は認められなかった。一方、PKAの活性化剤であるフォルスコリンを加えた条件では基底側からの圧によって引き起こされる上皮の重層化が抑制された。
これらの研究結果から肺癌において間質圧からの物理的な圧力が癌細胞の増殖亢進、極性異常に寄与しており、PKAシグナルがそのメカニズムに関与することが示唆されている。今後は間質圧の上昇による癌促進メカニズム解明をさらに進め、新たな治療法開拓を目指す予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究は概ね予定通りに進行している。本研究では6種類の肺癌細胞株を用いて検討を行ったが、管腔側と基底側の培地の水面差を維持できない細胞株が3種類認められた。解析の結果タイトジャンクションの形成不全が原因と考えられたため、ヒト肺癌細胞を採取して樹立した新たな細胞株を用いて解析を行い、検討に必要な種類の細胞株を得ることができた。COVID-19蔓延の影響により研究に従事する時間が一時的に制限され研究が滞っていた期間があったが、細胞増殖・アポトーシス・シグナルなどの検討では大きなトラブルはなく進めることができたため、研究は現在のところ予定通り進捗できていると考えている。また本研究に使用するfilter膜の生産がCOVID-19蔓延の影響を受けて2021年10月から止まっており、定量的な解析は来年度以降に行う予定である。上記のCOVID-19蔓延の影響のため、本年度の研究費の執行は予定よりも少額となった。
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| Strategy for Future Research Activity |
COVID-19蔓延のため供給が滞っているfilter膜については自作して対応する予定である。現在作成したfilter膜で実験条件を検討中である。
これまでの研究結果から基底側からの圧によって肺癌細胞の増殖の亢進や上皮の重層化が引き起こされ、PKAの活性化によってこれらの反応が抑制されることが分かっている。しかし、これまでのPhospho-kinase arrayを含めたシグナル経路の解析では特定のシグナル分子の活性変化は確認できていない。そこでマイクロアレイによる網羅的な発現解析を行い、基底側からの圧によって重層化などが引き起こされるメカニズムに関与する分子を特定する予定である。基底側から圧を加えると増殖が亢進してBrdU陽性細胞やKi67陽性細胞が増加するため、圧を加えてから増殖亢進が始まるまでのtime courseを確認して最適な条件を検討し、マイクロアレイによる解析を行う予定である。
また基底側から圧力が加わった条件では単層の上皮から管腔側に増殖した肺癌細胞が生存し続けることは重層化が生じるための要件の一つと考えられるが、細胞に圧がかかり管腔側に増殖した時点で生存し続けるために必要なphenotypeを獲得するのか、基底側から圧がかかっている環境が肺癌細胞の生存に必要なphenotypeを付与するのかについては分かっていない。そこで基底側から圧を加えて重層化した上皮の上から播いた細胞が生存できるかどうかを検討するためにGFPでラベルした細胞を用いて解析を行う予定である。
さらに癌細胞をヌードマウスに投与した移植モデルを用いて、マイクロアレイによって特定された分子の修飾やPKA活性化剤が腫瘍の増殖に及ぼす影響をin vivoで検討する予定である。
これらの解析によって間質圧の上昇が肺癌を促進するメカニズムをさらに解明し、新たな治療法を開拓する予定である。
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| Causes of Carryover |
COVID-19蔓延の影響により研究に従事する時間が一時的に制限されており研究が滞っていた期間があった。また本研究に使用するfilter膜の生産がCOVID-19蔓延の影響を受けて2021年10月から止まっており、購入が制限された。これらのCOVID-19蔓延の影響のため、本年度の研究費の執行は予定よりも少額となった。研究計画は一部の定量的な解析を除き概ね予定通り進行しており、次年度はマイクロアレイやヌードマウスを用いた解析など当初の研究計画に沿った実験を予定している。
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Research Products
(1 results)
