2022 Fiscal Year Research-status Report

Elucidation of interaction mechanism between sulfur-metabolizing bacteria and anti-tumor immunity within colorectal tumor microenvironment

Research Project

Project/Area Number	21K15582
Research Institution	Kurume University
Principal Investigator	藤吉健司久留米大学, 医学部, 助教 (70762798)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Keywords	大腸癌 / 腫瘍免疫 / 腸内細菌叢 / 癌微小環境 / 発癌メカニズム
Outline of Annual Research Achievements	本研究の2年目（令和4年度）は、大腸癌組織中の硫黄代謝細菌群（SMB）およびB. wadsworthiaの定量化を行っている。昨年度までに、同細菌の同定に2種のプライマー（Nプライマー・Bプライマー）を設計した。同2種のプライマーを用いてそれぞれPCRを行い、大腸癌組織中の細菌含有を確認した。Nプライマーでは、大腸癌組織に20例中5例、正常組織に20例中12例の標的細菌の存在を確認した。しかし、BプライマーはPCRではバンドが確認されなかった。理由として、Bプライマーは標的細菌群に対する特異度の高さから増幅されづらいことが想定された。次にNプライマーで増幅された細菌群の詳細な解析を行うこととし、次世代シークエンサーを用いて種レベルでの細菌の同定を試みた。しかし、B. wadsworthiaの癌組織中の細菌含有量が少なくアダプター付加によるPCRを要することとなり、現在はアダプター付加のためのPCR条件を設定している。そして、同時並行で、大腸癌組織中の腫瘍浸潤リンパ球・T細胞の測定・定量化を開始している。免疫染色を用いて、CD3陽性細胞・CD8陽性細胞の定量化している。まずは免疫染色スライドを用いて腫瘍内の5ヶ所でCD3陽性細胞数・CD8陽性細胞数を計測した。大腸癌症例80例において、CD3陽性細胞数およびCD8陽性細胞数が多い腫瘍では、少ない腫瘍と比較して、全生存期間が延長したことが明らかとなった。今後の研究計画としては、定量化することで硫黄代謝細菌群高菌量群と低菌量群に分類し、各群の腫瘍免疫の関連性を明らかにする。さらに、SMBが豊富な腫瘍の臨床・分子病理学的特徴を明らかにする。SMBが豊富な腫瘍の全トランスクリプトーム解析（もしくはRNAを用いた発現量解析）を行い、癌微小環境におけるSMBに特徴的なPathwayを明らかにしSMBの腫瘍増殖メカニズムを解明できる。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 大腸癌組織における腸内細菌の定量化を試みているが、定量化の手法に時間を要している。本研究で対象にしている硫黄代謝細菌群のなかでも、B. wadsworthiaは癌組織中に含まれる量が少ない。従って、高感度PCRや次世代シークエンサーを用いた解析を要するが、次世代シークエンサーにアダプター付加することで解析精度を高めるなどして正確な解析を行うことに時間を要している。一方で、腫瘍免疫の評価として、組織中の腫瘍浸潤リンパ球の定量化も先立って開始しおり予定通り進めるよう計画している。
Strategy for Future Research Activity	本年度の研究は、標的とする細菌（SMBおよびB. wadsworthia）の定量化を完了させる予定である。さらに、次世代シークエンサーを用いて定量化した細菌を種レベルまで確認する。その後、高感度PCRを用いて（digital PCR）それぞれの細菌を定量化する。そして、昨年度までに実施してきた腫瘍浸潤リンパ球の定量化データを用いて、定量化した菌量を比較検討することで、硫黄代謝細菌群高菌量群と低菌量群における腫瘍免疫の関連性を明らかにする。さらに、SMBが豊富な腫瘍の臨床・分子病理学的特徴(年齢/性/腫瘍部位/ステージ/組織型/KRAS/MSIなど)を解析し明らかにする。また、SMBが豊富な腫瘍の凍結サンプルを用いて、全トランスクリプトーム解析（もしくはRNAを用いた発現量解析）を行い、SMBが豊富な腫瘍の微小環境におけるPathway解析を実施する。この手法によりSMBが豊富な腫瘍での癌微小環境における腫瘍増殖メカニズムを明らかにすることができる。
Causes of Carryover	研究計画時に予定していた標的とする細菌（SMBおよびB. wadsworthia）の定量化が遅延した。現在、次世代シークエンサーのための準じを行っている。次世代シークエンサーの準備が整えばシークエンスを開始するが、シークエンス試薬が高額なため今後多額な出費が想定される。今後当シークエンスに予算を投じる予定である。さらに、全トランスクリプトーム解析やメタゲノム解析も実施することとなれば高額でありそれに出費が想定される。当初の研究予定よりも遅れてはいるものの、大幅な遅延ではないと考えている。