2022 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of neurodegenerative disease in T-type Ca channelopathies
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21K15630
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| Research Institution | Yokohama City University |
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Principal Investigator |
橋口 俊太 横浜市立大学, 医学部, 助教 (30884043)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 脊髄小脳失調症 / プルキンエ細胞 / カルシウムイメージング / T型カルシウムチャネル / RNAシークエンス / 光遺伝学 / パッチクランプ法 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
研究対象としてきた脊髄小脳失調症家系において電位依存性T 型カルシウムチャネルの一種である Cav3.1 をコードするCACNA1G のバリアント (c.5144G>A p.Arg1715His) を責任遺伝子として独自に同定し、ゲノム編集技術を用いて Cacna1g R1723H KI マウスを新規に作成・解析し、患者と同様の緩徐進行性の失調症状、小脳プルキンエ細胞変性をきたすことを証明し、疾患モデルとしての有用性を明らかにした。本研究では、新規に確立したSCA42モデルマウスを、分子生物学的、病理学的および電気生理学的手法を駆使しさらに多面的に解析することでチャネロパチーとしての神経変性の病態を解明し、病態に基づく根本治療開発へ繋げることを目的とした。
当該年度では、スパイン密度の解析を終え、脱落しているプルキンエ細胞に関してアポトーシスの関与を調べるためTUNEL染色を実施したが、有意な差異は認めなかった。さらに、高齢マウスにおいてプルキンエ細胞の細胞染色を行い、プルキンエ細胞の樹状突起の分枝について定量的な評価を計画している。遺伝子発現解析については、異なる週齢でのデータを比較して着目した分子について、RNAレベルおよび蛋白レベルでの定量化を試みている。電気生理学的解析では、治療薬候補であるT型カルシウムチャネル修飾薬の効果を培養細胞系で評価を行い、同薬剤が、電流電圧曲線への影響を及ぼさない点を確認した。さらに高齢マウスのスライスにおけるパッチクランプ法での薬剤効果を検証する実験系を計画している。また急性脳スライスを用いて樹状突起におけるCa流入についてカルシウムイメージング実験を計画する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
病理学的解析については、高齢マウスにおける小脳プルキンエ細胞の樹状突起スパイン密度の解析を終了した。小脳組織から抽出したRNAシークエンスにおける網羅的な解析については、若齢および高齢での複数ポイントでのデータ収集の実施中である。野生型と比較して発現に差異を認める候補分子を複数見出した。電気生理学的解析では、治療薬候補薬剤としてのT型カルシウムチャネル修飾薬の効果について、培養細胞系にトランスフェクションした実験系での実験を終了した。当初予定していたプロテオーム解析については、RNAシークエンスを優先的に実施したため、未だ実施していない。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究展開として、以下の3点に大別される。
①病理学的評価については、細胞染色を用いて残存するプルキンエ細胞の樹状突起分枝についての形態的な評価を実施する。また、光遺伝学的手法を用いたモデルマウスを用いた小脳組織切片の評価も計画する。
②遺伝子発現解析については、異なる週齢マウスでのデータを比較して着目した分子について、RNAレベルおよび蛋白レベルでの発現差異について、個体数を増やして解析を実施する。
③電気生理学的解析については、治療薬候補となるT型カルシウムチャネル修飾薬について、高齢マウスの脳スライスを用いた薬剤効果を検証する実験系を計画する。また、同時に急性脳スライスを用いて樹状突起におけるCa流入を評価するために、カルシウムイメージング実験を計画する。
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| Causes of Carryover |
国際学会での発表が見送られたため、次年度使用額が生じた。次年度では、学会発表および論文投稿時の推敲などについての使用資金とする計画である。
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