2022 Fiscal Year Research-status Report
3D培養腎細胞を用いた腎臓病早期診断法の開発と新規治療薬探索
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21K15663
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
越智 ありさ 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学域), 教務補佐員 (30831797)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | CKD / バイオマーカー / スフェロイド / エクソソーム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
慢性腎臓病（CKD）は『新たな国民病』と言われている。しかしながら、一部の腎炎を除き障害を受けた腎臓を治すための治療薬は開発されていない。また、腎臓病は自覚症状に乏しいため、多くの患者がCKDへと進行してしまう。こうした観点から、より早期の段階で腎炎診断を可能とするバイオマーカーの樹立が求められている。本研究では、２次元培養より生体腎に近い形質を有する糸球体様および尿細管様スフェロイドを用い各腎臓病を模倣するモデル培養系を作製する。作成したモデル培養系をRNA-sequenceにて解析を行い、早期のバイオマーカー候補の探索および、候補分子の変動を各病因のモデルマウスにて検討する。現在行われている腎症の確定診断は腎生検であり、患者への負担が大きく、非侵襲的な診断方法の確立が求められている。そこで、候補分子中から尿中にて抽出可能な分子を探索し、新規臨床検査方法の開発を目指す。
樹立したスフェロイドへの刺激添加による疾患モデル培養系が、生体内での反応と一致しているかを検討するため、本年度はスフェロイドからタンパクおよびmRNAの抽出および培養上清の回収し、細胞障害マーカー（Kim-1、NGAL）の発現増加レベルの検討を行った。また、スフェロイド培養上清中および腎臓病患者尿よりエクソソームを抽出し、エクソソーム内に含まれる分子について解析中である。
また、新規腎臓病治療薬の候補薬探索に向け、スフェロイドの大量培養方法についての検討を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
腎臓病モデル培養系において、スフェロイドでは線維化マーカー(SMA,Col4)の発現より早期に既存の細胞障害マーカーであるkim-1およびNGALの発現が増加することを確認した。また、線維化マーカーおよび細胞障害マーカー発現時のスフェロイド培養上清を回収し、エクソソームの抽出を行った。各腎疾患モデル培養系において、疾患特異的なバイオマーカーをRNAまたはエクソソーム内分子中から現在選定中である。
次年度予定の新規治療薬の探索の予備実験として、スフェロイドの大量培養方法の構築を行った。これにより一度に数百の化合物についてスクリーニングを行うことが可能となった。
以上により、概ね順調に進展していると評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
各腎臓疾患モデル培養系にてバイオマーカーの最終選定を行う。これまでに、RNAレベルでの発現変動を確認しているが、スクリーニング系でのハンドリングをふまえ、培養上清を用いたELISAにて変動が確認できるバイオマーカーを決定する。
バイオマーカーを選定した培養系においては、repositioning drugを中心としたスクリーニングを行う。腎保護効果を持つと考えられる薬剤については、疾患モデルマウスへの投与を行い、選定したバイオマーカーの尿中および組織内での発現変動の確認、および腎組織の分子病理学的な改善の確認を行う。
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| Causes of Carryover |
今年度、患者尿中からの細胞を用いたスフェロイド作製予定であったが、新型コロナウイルス感染蔓延の影響を受け、患者細胞を用いないスフェロイド培養系の構築を主に行った。その結果、予定額より少額で賄えたために次年度使用額が生じた。翌年度分として請求した研究費とあわせて、次年度は患者尿中細胞を用いたスフェロイドの作製に使用する予定である。
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