細胞外小胞に内包される神経・グリア特異蛋白を用いた認知症血液バイオマーカーの開発

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K15682
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 赤嶺 祥真 大阪大学, 大学院医学系研究科, 助教 (00846222)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 細胞外小胞 / プロテアーゼ保護アッセイ / エクソソーム / バイオマーカー / アルツハイマー病

Outline of Annual Research Achievements

本年度は、初年度に引き続いてプロテアーゼ処理条件の最適化を実施した。最適化に際しては、一定量の血漿EV分画に含まれる大部分がEV外に存在すると考えられるタンパクが十分に消化されること、および下流測定系への影響が最低限となるようにプロテアーゼが不活化されることを主な指標とした。
非EV関連タンパクおよびEV関連タンパクのうち膜外に一部ないし全体が露出していると考えられるものについて、複数種類においてwestern blottingによる検討を行った。初年度で同定された「EV外に一部が露出しているにも関わらず、プロテアーゼによる分解を受けない、翻訳後修飾によるプロテアーゼ耐性を持つタンパク」を除いて、EV外タンパクが十分に消化される条件を、複数の組み合わせ（酵素濃度・反応温度・時間など）で同定した。
続いて、この条件群に対して、プロテアーゼ活性を十分に阻害するのに必要な阻害条件を検討した。酵素阻害が十分に行われた事の確認には、自己消光を応用したFTC-Casein系によるプロテアーゼ活性アッセイを用いた。この結果、複数の反応条件候補（酵素濃度・反応温度・時間・阻害手法の組み合わせ）を得た。
これらのうち、高温での処理を必要とするものは高感度測定系に移行する際にアナライトの変性等を惹起する可能性があるために一時的に検討対象外とし、より穏やかな温度条件で実施可能な他の条件群について、高感度測定系での適合性を評価した。
その結果、最もバックグラウンドシグナルが低い反応条件を絞りこむことが出来た。この条件において、少ないサンプル数では神経・グリア細胞に特異的なタンパクが測定可能であることを確認した。
次年度（最終年度）は、この反応条件に基づいて患者血漿における測定を実施し、その妥当性および再現性を検証する。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の予定通り、血漿からの細胞外小胞を分離したのちのプロテアーゼ処理法の条件検討を実施し、適切と思われる条件を見出した。

Strategy for Future Research Activity

現行の仮説を維持し、設定した反応条件において健常者・認知症患者の血漿を処理し、高感度測定系（Simoa）で測定する事で再現性・安定性および臨床的な妥当性評価を試みる。

Causes of Carryover

高感度測定系に影響する酵素処理測定条件の検討が順調に進み、想定よりも少ない試薬量で条件の検討を進める事ができたため。次年度使用額については、より大きいサンプルサイズで再現性・妥当性および信頼性の検証を行うことで、より確実な結果を見出す事を試みる。